EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3ζ慢病毒表達載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、背景：
　　過繼免疫治療(adoptive immunotherapy，AIT)是腫瘤免疫治療的重要方法之一，顯現(xiàn)出了一定的抗腫瘤作用。近年來，嵌合抗原受體(chimeric antigenreceptor，CAR)修飾T淋巴細胞的靶向免疫治療新策略，賦予T淋巴細胞持久的生命力，更強的增殖性，靶向殺傷活性，進一步提高了AIT的療效。表皮生長因子受體Ⅲ型突變體(epidermal growth factor receper vari

2、antⅢ EGFRvⅢ)在腦膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中表達率較高，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是腫瘤靶向治療的理想分子靶點。本研究設(shè)計第三代嵌合抗原受體EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3ζ，構(gòu)建慢病毒表達載體，為嵌合抗原受體修飾T淋巴細胞的腫瘤免疫治療提供實驗條件。
　　目的：
　　構(gòu)建嵌合抗原受體EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3ζ慢病毒表達載體，包裝嵌合抗原受體基因表達的慢病毒，體外感染293

3、T細胞，使之高效表達該基因，為提高過繼免疫治療的抗腫瘤活性提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　　靶向EGFRvⅢ的第三代嵌合抗原受體由EGFRvⅢscFv(726bp)、鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)(213bp)，CD28(123bp)、CD137胞內(nèi)信號區(qū)(126bp)，CD3ζ鏈(336bp)組成，通過Oligo化學(xué)合成、PCR擴增方法，成功合成嵌合抗原受體EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3ζ的基因，將目的基因克隆入載體pC

4、DH-CMV-MCS-EF1-copGFP的EcoR1和BamH1位點，進行雙酶切及測序驗證后，與慢病毒包裝質(zhì)粒pVSVG和pDel8.9共轉(zhuǎn)染293T細胞包裝成慢病毒，測定病毒滴度，慢病毒感染293T細胞，Western blot檢測目的基因表達。
　　結(jié)果：
　　EGFRvⅢscFv和基因合成的CD28-CD137-CD3ζ片段，通過重疊PCR拼接成EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3ζ(EGFRvⅢ/CA

5、R)，目的基因EGFRvⅢ/CAR和表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP通過EcoR1和BamH1雙酶切后連接，經(jīng)過雙酶切和測序證實目的基因EGFRvⅢ/CAR克隆入慢病毒表達載體內(nèi)并且序列正確，成功包裝了慢病毒，病毒滴度為1.5×108TU/ml，感染293T細胞、提取細胞中的蛋白質(zhì)，CD3ζ抗體免疫印跡證實EGFRvⅢ/CAR的表達（分子量約58KDa）。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建嵌合抗原受體EGFRv