IGF-1R-GPCR串話在靶向IGF-1R治療腫瘤中的作用及機制研究.pdf

1、癌癥是當(dāng)今世界最重要的公共健康問題之一。腫瘤發(fā)生過程中，其利用細(xì)胞外信號來實現(xiàn)自身的細(xì)胞增殖，遷移和凋亡逃逸，從而獲得超越正常細(xì)胞的生長優(yōu)勢。上述細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一部分是由細(xì)胞膜受體所產(chǎn)生的。目前的細(xì)胞膜受體研究主要包括兩大類:G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors,GPCR)和生長因子受體即受體酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases，RTK）。
　　G蛋白偶聯(lián)受體是體內(nèi)最大

2、的(＞1000)細(xì)胞膜受體家族，它介導(dǎo)了體內(nèi)大部分生理及病理過程。
　　受體酪氨酸激酶家族(RTKs)是一個包括約60名成員的細(xì)胞膜表面受體家族。
　　Figitumumab(CP)是一種IGF-1R的人源化單抗，設(shè)計該抗體的初始目的是阻斷配體受體結(jié)合，然而CP還可誘導(dǎo)明顯的受體降解下調(diào)。進一步研究表明該靶向抗體可以作為一種“偏倚性的”IGF-1R激動劑招募β-arrestin1到IGF-1R并引起受體泛素化、內(nèi)吞及降解和E

3、RK1/2信號的激活。上述研究進一步證明了作為典型RTK的IGF-1R具備了某些GPCR的功能，因此IGF-1R/GPCR的串話新機制將為IGF-1R的靶向治療帶來新的思路和理論依據(jù)。
　　本課題將深入探索IGF-1R/GPCR串話的分子機制。明確β-arrestins及GRKs在偏倚性配體CP刺激下的作用，發(fā)現(xiàn)調(diào)控IGF-1R信號通路的關(guān)鍵分子。本課題還將利用質(zhì)粒定點突變及轉(zhuǎn)染技術(shù)證實IGF-1R/GPCR串話的存在，這將為IG

4、F-1R的靶向治療走向臨床提供新的希望。
　　第一部分 靶向IGF-1R治療食管癌的作用及分子機制研究
　　研究目的：
　　1.明確食管癌中IGF-1R的表達及其與患者預(yù)后的關(guān)系;
　　2.探討IGF-1R單抗CP在食管癌中的治療作用;
　　3.探索CP是IGF-1R的一種偏倚性配體及其對IGF-1R下游信號通路的影響。
　　研究方法：
　　1.選取于山東省立醫(yī)院胸外科手術(shù)的食管癌病理標(biāo)本110

5、例，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測IGF-1R的表達情況，統(tǒng)計學(xué)分析受體表達與食管癌病人臨床病理特點及預(yù)后的聯(lián)系。
　　2.采用細(xì)胞增殖、克隆形成、劃痕實驗及凋亡蛋白檢測探索CP在食管癌細(xì)胞系中的治療作用。
　　3.免疫印跡技術(shù)檢測相關(guān)信號通路激活及蛋白水平。
　　4.免疫共沉淀技術(shù)檢測相關(guān)蛋白結(jié)合情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.110例食管癌臨床切除標(biāo)本中，分別有25、21、48、16例標(biāo)本IGF-1R表達評分

6、為0、1、2、3。0和1為低表達，2和3為受體高表達?？ǚ綑z驗提示IGF-1R表達和性別相關(guān)，與其他臨床特點不相關(guān)。生存分析表明IGF-1R高表達患者預(yù)后不良，是食管癌的一個獨立預(yù)后指標(biāo)。
　　2.CP可抑制食管癌細(xì)胞的生長以及增加腫瘤細(xì)胞對常用化療藥物的敏感性。此外，CP可抑制IGF-1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、克隆形成及抗凋亡作用。
　　3.TE-1細(xì)胞的基礎(chǔ)ERK1/2磷酸化水平較Eca-109更加明顯，IGF-1刺激

7、10分鐘，兩個細(xì)胞系均有明顯的IGF-1R磷酸化及下游的Akt和ERK1/2的磷酸化。細(xì)胞系使用CP預(yù)處理一小時后，IGF-1刺激，結(jié)果提示CP預(yù)處理組細(xì)胞IGF-1R磷酸化受阻，Akt未見激活，而ERK1/2的磷酸化水平較弱且延遲。此外，完全培養(yǎng)基情況下，CP處理的細(xì)胞IGF-1R磷酸化水平降低。
　　4.對比IGF-1和CP引起的受體下調(diào)顯示CP引起的受體降解下調(diào)更明顯。免疫共沉淀結(jié)果表明受體的泛素化是二者下調(diào)受體的機制。蛋白

8、酶體途徑抑制劑處理后，CP引起的IGF-1R下調(diào)明顯受阻。二者刺激下細(xì)胞均可見IGF-1R與β-arrestin1的結(jié)合。過表達β-arrestin1增加CP誘導(dǎo)的受體降解，而沉默β-arrestin1則部分抑制CP誘導(dǎo)的受體下調(diào)。
　　5.IGF-1和CP分別直接刺激食管癌細(xì)胞，同IGF-1相比，CP引起下游的ERK1/2磷酸化程度較弱，并且CP引起ERK1/2的活化時間延遲。下調(diào)β-arrestin1的表達可以降低CP誘導(dǎo)的E

9、RK1/2的磷酸化。ERK1/2的抑制劑U0126可增加食管癌細(xì)胞對CP的敏感性。
　　6.過表達GRK2或者沉默GRK6，CP誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化早期稍微增強而晚期明顯減弱、IGF-1R下調(diào)程度降低;沉默GRK2或者過表達GRK6，CP誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化早期減弱而晚期明顯增強、且IGF-1R下調(diào)程度增加。
　　研究結(jié)論：
　　1.IGF-1R的表達是食管癌完全切除患者的一個獨立預(yù)后指標(biāo)。IGF-1R的單抗

10、CP在體外對食管癌具有一定的治療作用。
　　2.CP不僅可阻斷IGF-1R的自體磷酸化及下游Akt和ERK1/2的激活，還可以引起β-arrestin1依賴性的受體泛素化下調(diào)。
　　3.CP單獨可引起β-arrestin1介導(dǎo)的ERK1/2磷酸化激活，說明CP具有IGF-1R的部分激動劑活性。
　　4.GRK2和GRK6介導(dǎo)了CP誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化激活和受體下調(diào)證實了CP是IGF-1R的一種偏倚性配體。
　

11、　第二部分 IGF-1R作為一種RTK/GPCR的功能雜合體的機制研究
　　研究目的：
　　1.明確IGF-1R的1248及1291位絲氨酸在受體降解及下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用;
　　2.探索IGF-1R酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域?qū)κ荏w降解及下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響;
　　3.探索突變體質(zhì)粒對細(xì)胞周期的影響。
　　研究方法：
　　1.HEK-293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染IGF-1R野生型(wt)、酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域突變(TM)、12

12、48和1291位絲氨酸單突變(48A、48D、91A、91D)和雙突變(AD、AA、DD、DA)以及雙突變與TM聯(lián)合的三突變質(zhì)粒。
　　2.IGF-1刺激相應(yīng)時間后，免疫印跡檢測下游信號通路及受體的降解。
　　3.IGF-1刺激細(xì)胞后，碘化丙啶染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。
　　研究結(jié)果：
　　1.IGF-1刺激后，免疫印跡結(jié)果提示wt轉(zhuǎn)染細(xì)胞受體降解呈線性下降。AA、AD轉(zhuǎn)染細(xì)胞受體基礎(chǔ)降解少，而DA、DD轉(zhuǎn)染

13、細(xì)胞受體降解增多;但是AA、DA轉(zhuǎn)染細(xì)胞IGF-1誘導(dǎo)的降解速率降低，而AD、DD轉(zhuǎn)染細(xì)胞IGF-1誘導(dǎo)的受體降解速率明顯增加。
　　2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染TM質(zhì)粒后，其受體表達水平與轉(zhuǎn)染wt質(zhì)粒的受體表達水平相當(dāng)。而三突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞受體降解機制與雙突變體質(zhì)粒相似，即1248位絲氨酸調(diào)控受體基礎(chǔ)水平的循環(huán)，而1291位絲氨酸調(diào)節(jié)配體誘導(dǎo)的受體降解。
　　3.IGF-1刺激后，免疫印跡結(jié)果提示wt轉(zhuǎn)染細(xì)胞ERK1/2磷酸化在5分鐘

14、達峰值，隨之逐漸下降; AD轉(zhuǎn)染后細(xì)胞晚期ERK1/2激活增多，早期則降低;而DA轉(zhuǎn)染細(xì)胞ERK1/2激活則與AD相反;而DD轉(zhuǎn)染細(xì)胞早期及晚期ERK1/2均稍增多;相反的，AA轉(zhuǎn)染后兩相ERK1/2激活均降低。
　　4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染TM后其ERK1/2激活較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞總體尤其是早期明顯偏弱?？赡苁荰M與內(nèi)源性IGF-1R形成雜化二聚體，阻礙了內(nèi)源性IGF-1R的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。三突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后ERK1/2激活的機制與雙突變質(zhì)粒相似，

15、即1248位絲氨酸調(diào)節(jié)ERK1/2第一相激活，而1291位絲氨酸調(diào)節(jié)第二相激活。
　　研究結(jié)論：
　　1.IGF-1R的C端1248位絲氨酸調(diào)節(jié)ERK1/2的第一相活化，而1291位絲氨酸調(diào)控ERK1/2第二相活化。
　　2.IGF-1R的C端1248位絲氨酸調(diào)節(jié)受體的基礎(chǔ)循環(huán)回收，而1291位絲氨酸調(diào)控配體誘導(dǎo)的受體降解。
　　3.IGF-1R的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域突變體與IGF-1R/GPCR串話相互獨立。

16、>　　第三部分 IGF-1R單克隆抗體治療腫瘤的不良反應(yīng)概述
　　研究目的：
　　靶向IGF-1R治療實體腫瘤是近十余年來的一個研究熱點，而針對IGF-1R的單克隆抗體是其中發(fā)展較快的一個分支。本研究的目的是系統(tǒng)性綜述IGF-1R單克隆抗體在治療腫瘤中的不良反應(yīng)事件。
　　研究方法：
　　在Pubmed數(shù)據(jù)庫中檢索”IGF-1R monoclonal antibody”的相關(guān)文獻共389篇。經(jīng)過詳細(xì)的篩選后有15

17、篇臨床研究納入了下述的分析。收集了各種報道的不良反應(yīng)及其發(fā)生率，并計算其總體的發(fā)生率。隨后根據(jù)年齡分組，比較了不同年齡組之間、單抗單獨及與化療藥物合并、各單抗之間不良反應(yīng)發(fā)生率及種類的差異。
　　研究結(jié)果：
　　低年齡組中單抗治療的不良反應(yīng)較高齡組患者較多且重，19種不良反應(yīng)中的13種不良反應(yīng)發(fā)生率在單獨用藥中較聯(lián)合用藥者為低(P＜0.05)。接受R1507治療患者的不良反應(yīng)發(fā)生率要顯著高于cixutumumab和figit