IR和IGF-1R在糖尿病大鼠拔牙窩愈合過程中的表達及作用.pdf

1、糖尿病是嚴重威脅人類健康的慢性病之一，其中90％以上為2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者。糖尿病曾是人工種植體的禁忌證，但新的研究表明良好的血糖控制可提高糖尿病患者人工種植牙成功率。目前控制血糖最常用最有效的藥物是胰島素。劉洪臣等提出胰島素局部給藥對成骨細胞有保護作用，并在臨床成功應(yīng)用于糖尿病患者種植體局部獲得良好效果。課題組通過體外實驗已經(jīng)證實適量濃度胰島素影響成骨細胞的增殖和分化，而且發(fā)現(xiàn)成

2、骨細胞上有胰島素受體的表達。胰島素必須與受體結(jié)合才能發(fā)揮其生理學(xué)效應(yīng)，受體的數(shù)目和與胰島素的親和力同胰島素的生物學(xué)效應(yīng)有直接關(guān)系。胰島素受體（insulin recoptor，IR）和胰島素樣生長因子-I受體（insulin-like growth factor-I receptor，IGF-IR）屬于胰島素樣生長因子系統(tǒng)家族（insulin like growth fatctors，IGFs）的受體酪氨酸激酶，雖然兩者具有高度相似的分

3、子結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)信號系統(tǒng)，但是IR和IGF-IR在代謝過程、細胞增殖分化中發(fā)揮著不同作用，尤其將胰島素局部應(yīng)用于糖尿病大鼠拔牙窩后兩種受體的表達和變化尚不清楚。Goto-Kakizaki（GK）大鼠是與人類2型糖尿病近似的自發(fā)性非肥胖2型糖尿病鼠種，主要表現(xiàn)為葡萄糖刺激的胰島素分泌受損出現(xiàn)的胰島素分泌絕對不足。本實驗選用適宜生理濃度的胰島素，利用殼聚糖/p-甘油磷酸鈉凝膠（chitosan/β-glyceroplaosphate，C/GP

4、）系統(tǒng)，將胰島素溶液凝膠化后局部注射到GK大鼠拔牙窩中，觀察IR和IGF-1R的表達與變化以及拔牙窩愈合過程中新生骨組織形成，初步探討兩種受體在糖尿病大鼠拔牙窩愈合過程中的作用。
　　 第一部分 胰島素對下頜骨成骨細胞增殖的影響及IR和IGF-1R在成骨細胞上的表達
　　 目的：探討適宜濃度對成骨細胞生長增殖的影響，觀察IR和IGF-1R在成骨細胞上的表達。
　　 方法：原代培養(yǎng)Wistar大鼠下頜骨成骨細胞并鑒

5、定，分別用正常及高糖濃度的培養(yǎng)液配制的不同濃度梯度胰島素溶液，然后以不同濃度胰島素液通過培養(yǎng)成骨細胞用噻唑藍法（MTT法）檢測成骨細胞的增殖，確定藥物最適濃度；免疫組織化學(xué)法檢測體外成骨細胞上IR和IGF-1R的表達。
　　 結(jié)果：通過酶消化法成功培養(yǎng)了原代大鼠下頜骨成骨細胞；在相同濃度胰島素條件下MTT結(jié)果顯示成骨細胞在低糖培養(yǎng)基中增殖活躍；在四組不同胰島素濃度10-6M濃度下成骨細胞增殖最為顯著。在體外成骨細胞上IR和IGF

6、-1R均陽性表達。
　　 結(jié)論：高糖條件抑制了大鼠下頜骨成骨細胞的增殖；在兩種糖濃度下，10-6M胰島素能顯著促進大鼠下頜骨成骨細胞的增殖；而且成骨細胞均表達IR和IGF-1R蛋白。
　　 第二部分 胰島素凝膠緩釋系統(tǒng)的制備
　　 目的：用C/GP凝膠系統(tǒng)結(jié)合胰島素制備胰島素緩釋凝膠，并檢測胰島素凝膠效能。
　　 方法：高效液相色譜法測定胰島素局部給藥凝膠系統(tǒng)釋出胰島素的量及釋放趨勢，同時檢測胰島素凝膠系

7、統(tǒng)中β-甘油磷酸鈉濃度、pH值對于凝膠系統(tǒng)從水溶液轉(zhuǎn)變?yōu)槟z時間的影響以及釋出胰島素影響。
　　 結(jié)果：C/GP凝膠系統(tǒng)在25℃下呈液態(tài)，37℃時約8min形成凝膠，凝膠形態(tài)良好，并且在負載了胰島素溶液后殼聚糖/β-GP凝膠形態(tài)未受影響；GP含量、pH值影響C/GP系統(tǒng)膠凝時間；GP在C/GP系統(tǒng)中終含量為5.6％時胰島素體外釋放較為理想。
　　 結(jié)論：成功制備了胰島素殼聚糖/β-甘油磷酸鈉凝膠系統(tǒng)，確定了適當?shù)腉P含量

8、和pH值范圍。
　　 第三部分 胰島素凝膠局部給藥促進GK大鼠拔牙窩愈合作用的觀察及IR和IGF-1R在拔牙窩愈合過程中的表達及變化
　　 目的：通過組織學(xué)、免疫組織化學(xué)觀察取和IGF-1R在GK大鼠拔牙窩愈合過程中成骨情況的表達及變化，探討胰島素通過兩種受體影響糖尿病大鼠拔牙窩愈合的機理。
　　 方法：手術(shù)拔除大鼠下頜骨左側(cè)切牙；拔牙窩局部注射胰島素凝膠，設(shè)4組：正常大鼠拔牙組（WN）； GK大鼠拔牙組（GN）

9、、GK大鼠無胰島素C/GP凝膠注射組（G1）、GK大鼠胰島素C/GP凝膠注射組（G2）；分別在拔牙后7d，14d，21d，28d取材，通過X線觀察、組織形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)法及qPCR觀察IR和IGF-1R在GK大鼠拔牙窩愈合過程中的表達及變化，分析胰島素結(jié)合兩種受體與下頜骨拔牙窩愈合的機理。
　　 結(jié)果：注射C/GP凝膠于下頜骨拔牙窩后，G2組大鼠血糖檢測無統(tǒng)計學(xué)差異；免疫組織化學(xué)觀察IR和IGF-1R均在成骨細胞的胞漿上陽性

10、表達，IGF-1R陽性表達細胞多位于拔牙窩新生骨小梁周圍，IR陽性表達的細胞位于拔牙窩內(nèi)骨陷窩周圍；IGF-1R陽性表達的細胞多于IR陽性表達的細胞。HE染色觀察在G1，G2組28d時未見有C/GP；Goldner’s三色法觀察G2組在拔牙后28d拔牙窩內(nèi)出現(xiàn)不規(guī)則骨基質(zhì)和少許的新生骨小梁，圍繞新生骨小梁周圍的成骨細胞明顯活躍，立方形、多邊形的成骨細胞多見。在大鼠拔牙窩7-28d愈合過程中，WN組IR mRNA水平表現(xiàn)為持續(xù)下降，GN組

11、則表現(xiàn)為IRmRNA水平在14d達到高峰后開始下降為先升高后降低的趨勢，G1組也表現(xiàn)為先升高后降低趨勢，21d時達到高峰，隨后在28d時降到7d時水平，G2組與WN組表現(xiàn)一致，在7-28d過程中持續(xù)下降，其中GN組的IRmRNA水平最高（p<0.01），G1、G2組與WN組相近均低于GN組；此過程中GN、G1組的IGF-1R mRNA水平較低，G2組在7d，14d，21d明顯高于其它兩組，并在21d時達到峰值，WN組14d，21d顯著高