IGF-Ⅰ、Ⅱ及其受體IGF-ⅠR、ⅡR在牛早期胚胎中的表達和作用研究.pdf

1、胰島素樣生長因子(IGF)和一些與它相關(guān)的成分構(gòu)成了一個復(fù)雜的生長因子家族，它們對早期胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)起著重要的作用。本研究主要通過RT-PCR方法和免疫熒光標(biāo)記檢測了IGF-I、II和IGF-IR、IIR在牛卵母細胞、早期胚胎中的表達情況，在成熟培養(yǎng)液和發(fā)育培養(yǎng)液中添加不同劑量的IGF-I、II，觀察其對卵母細胞和胚胎發(fā)育的影響，采用RNAi的方法進一步探討了IGF-IR在牛早期胚胎發(fā)育中的作用。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　

2、⑴通過RT-PCR的方法檢測了·IGF-I、II和IGF-IR、IIR mRNA在卵母細胞、早期胚胎中的表達情況。結(jié)果顯示在卵母細胞和早期胚胎中均檢測到IGF-II和IGF-IR、IIR mRNA的表達；但是始終未檢測到IGF-I mRNA的表達。
　　 ⑵對IGFs蛋白在牛卵母細胞和早期胚胎中的表達進行了定位。通過免疫熒光標(biāo)記和激光共聚焦觀察檢測IGF-II和IGF-IR、IIR蛋白在卵母細胞、早期胚胎中的表達情況。結(jié)果表明I

3、GF-II和IGF-IR、IIR的表達情況基本一致：它們在卵母細胞和二細胞期胚胎中主要集中在細胞邊緣如膜及膜下區(qū)域；并且存在于COC的顆粒細胞中，以及8細胞期胚胎和桑椹胚的整個卵裂球細胞質(zhì)中；在囊胚的滋養(yǎng)層細胞中可以檢測到這些蛋白，但是在內(nèi)細胞團中沒有檢測到。
　　 ⑶觀察了在牛卵母細胞成熟培養(yǎng)液中添加IGF-II對胚胎發(fā)育的影響。將采集到的COCs隨機平均分成五組，分別成熟培養(yǎng)于含有0(對照)、10、20、50、100 ng/

4、ml IGF-II的M199+0.6%BSA的成熟培養(yǎng)液中，經(jīng)過成熟培養(yǎng)、受精和發(fā)育培養(yǎng)后，統(tǒng)計胚胎的發(fā)育率和囊胚凋亡細胞數(shù)。結(jié)果表明各添加組與對照組之間對卵裂率的影響沒有顯著差異。但是在8細胞胚胎發(fā)育率上，20 ng/ml添加組(58.2%)明顯高于對照組(44.5%)(P<0.05)；而且在囊胚發(fā)育率方面，20 ng/ml添加組最高(37.0%)，明顯高于其他各組(25.0%，33.3%，24.8%，21.2；P<0.05)。20

5、ng/ml添加組的囊胚細胞數(shù)(126)也明顯高于對照組(103，P<0.05)，但是囊胚細胞中的死細胞比率在各組間沒有明顯差異。
　　 ⑷在SOF+PVA培養(yǎng)液中添加不同劑量的IGF-I對早期胚胎進行發(fā)育培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果顯示，添加0、1、5和10 ng/mlIGF-I的8細胞期胚胎發(fā)育率和囊胚發(fā)育率分別為55.1%、55.1%、62.9%、60.9%和18.9%、19.6%、24.2%、22.7%，結(jié)果表明8細胞期胚胎發(fā)育率與囊胚

6、發(fā)育率在各組之間無顯著差異，5 ng/ml組發(fā)育效果最好。
　　 ⑸觀察了在發(fā)育培養(yǎng)液中添加IGF-II對胚胎發(fā)育的影響。在SOF+PVA培養(yǎng)液中添加不同劑量的IGF-II對早期胚胎進行發(fā)育培養(yǎng)，發(fā)育數(shù)據(jù)顯示，添加0、50、100和150 ng/ml IGF-II的8細胞期胚胎發(fā)育率和囊胚發(fā)育率分別為63.6%、68.9%、61.3%、63.9%和19.2%、21.7%、30%、25.9%，結(jié)果表明8細胞期胚胎發(fā)育率在各組之間無

7、顯著差異；100 ng/ml組囊胚發(fā)育率明顯高于對照組，有顯著性差異(P<0.05)。
　　 ⑹利用軟件設(shè)計siRNA干涉序列，并對合成回來的序列進行干涉效果檢測。對未成熟卵母細胞注射IGF-IRsiRNA和對照siRNA，然后在加有成熟抑制劑的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)6小時和24小時后對IGF-IR mRNA進行定量PCR檢測。結(jié)果顯示注射6小時和24小時后IGF-IR mRNA表達量分別降為72%和54%。對受精卵注

8、射IGF-IR siRNA，于培養(yǎng)24小時后檢測卵裂胚的mRNA和蛋白表達，發(fā)現(xiàn)均有所減少。結(jié)果表明，本實驗所設(shè)計的IGF-I siRNA具有良好的干涉效果，可以用于IGF-I基因敲減的研究。
　　 ⑺注射IGF-IR siRNA的受精卵經(jīng)發(fā)育培養(yǎng)，于受精后第八天統(tǒng)計發(fā)育率和囊胚細胞數(shù)；未注射組、注射對照siRNA組、注射IGF-IR siRNA組的8細胞期胚胎發(fā)育率、囊胚發(fā)育率分別為48.8%、46.7%、38.9%和35.4

9、%、33.0%、23.3%；各組囊胚細胞數(shù)分別為：116、81、64。結(jié)果表明，各組在8細胞期胚胎發(fā)育率方面沒有顯著差異，但是在囊胚發(fā)育率方面注射IGF-IR siRNA組明顯低于兩對照組，有顯著差異(P<0.05)；在囊胚細胞數(shù)方面，注射后的囊胚細胞數(shù)明顯低于未注射組(P<0.05)，注射對照siRNA組囊胚細胞數(shù)明顯比注射IGF-IsiRNA組囊胚細胞數(shù)多，具有顯著差異(P<0.05)。
　　 ⑻研究結(jié)果表明，在牛卵母細胞和