HIV-1單克隆中和抗體Y498的抗病毒活性和機(jī)制研究.pdf

1、為實(shí)現(xiàn)預(yù)防、治療和治愈艾滋病的目標(biāo)，近二十年來(lái)基于HIV-1中和抗體的研究成為熱點(diǎn)。這些HIV中和抗體為通過(guò)技術(shù)手段在艾滋病感染者血液中分離、鑒定和改造的具有廣譜中和活性的抗體，HIV中和抗體在疫苗設(shè)計(jì)和免疫治療艾滋病感染者中發(fā)揮重要作用。
　　目前為止，中國(guó)已發(fā)現(xiàn)了A、B'、B、C、CRF_D2(CRF07_BC/CRF08_BC)、CRF01_ AE、CRF02_AG7種亞型的HIV病毒，其中HIV B/C、A/E重組亞型毒株

2、已成為中國(guó)主要的流行毒株。
　　本論文以中國(guó)流行株B/C亞型病人為研究對(duì)象，在前期篩選到Y(jié)498Fab抗體的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)該抗體的抗病毒活性和機(jī)制進(jìn)行了研究。在前期大規(guī)模篩選人源單克隆抗體的基礎(chǔ)上，我們首先表達(dá)純化了Y498Fab形式的抗體，通過(guò)活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗體Y498Fab具有交叉反應(yīng)活性和中和活性，之后成功構(gòu)建了全分子Y498(Y498IgG)抗體，進(jìn)行活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Y498對(duì)HIV-1 B、C、B/C多種亞型抗原具有交

3、叉反應(yīng)活性，同樣對(duì)指示毒株NL4-3和SF162具有中和活性，SPR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Y498抗體與JRFL抗原有著非常強(qiáng)的親和力，KD值為0.86nM，均高于b12(1.11nM)和VRC01(5.35nM);與CN54抗原同樣有著非常強(qiáng)的親和力，KD值為0.46nM，均高于b12(13.28nM)和VRC01(25.29nM)。而針對(duì)被檢測(cè)的八個(gè)業(yè)型81株假病毒中，Y498能夠有效中和高達(dá)26％(21/81)的假病毒株，在81株假病毒中，有

4、43株中國(guó)株，Y498能夠中和其中的12株，占28％，而在所有被檢測(cè)的B/C亞型中國(guó)株中，Y498的中和能力達(dá)到32％，且Y498對(duì)部分假病毒株中和能力強(qiáng)于b12和VRC01。提示該抗體具有一定的廣譜中和活性。
　　我們進(jìn)一步對(duì)Y498的抗病毒機(jī)制做了研究。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Y498抗體與b12抗體一樣，識(shí)別HIV-1包膜刺突上gp120的構(gòu)象表位，隨后的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其識(shí)別gp120上的CD4結(jié)合區(qū)，并與b12和VRC01競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。生物信

5、息學(xué)分析預(yù)測(cè)Y498抗體所識(shí)別的表位，聯(lián)合篩選噬菌體隨機(jī)展示文庫(kù)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，兩者共有15個(gè)氨基酸位點(diǎn)重疊，我們以噬菌體12肽隨機(jī)展示文庫(kù)篩選到的6條肽段為基礎(chǔ)，利用Pepitope service軟件對(duì)Y498所識(shí)別的表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，共得到24個(gè)可能的表位氨基酸殘基，對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)一步定點(diǎn)突變進(jìn)行活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)重要的氨基酸位點(diǎn)影響了Y498抗體的結(jié)合活性，分別為F277，D279，D368，E370，該4個(gè)位點(diǎn)均位于gp120的CD4結(jié)

6、合區(qū)內(nèi)，隨后的針對(duì)突變株中和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有2個(gè)氨基酸位點(diǎn)影響了該抗體的中和能力，分別為D368，E370，并且它們同時(shí)影響了Y498抗體的結(jié)合活性和中和活性，據(jù)此認(rèn)為D368和E370為Y498抗體識(shí)別表位的關(guān)鍵位點(diǎn)。將這些Y498抗體表位相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)與VRC01和b12相比較，發(fā)現(xiàn)D279為VRC01的關(guān)鍵位點(diǎn)，D368和E370為b12的關(guān)鍵位點(diǎn)，該結(jié)果與Y498分別競(jìng)爭(zhēng)VRC01和b12相吻合。少數(shù)情況下，突變導(dǎo)致了中和活性的提

7、高，推測(cè)主要由于單個(gè)氨基酸突變不足以破壞高親和力抗體結(jié)合配體，這種情況同時(shí)印證了VRC01的類似中和機(jī)制。結(jié)合CD4在gp120上的結(jié)合位點(diǎn)分布，利用PyMOL軟件將Y498抗體所識(shí)別的表位氨基酸進(jìn)行展示，發(fā)現(xiàn)該四個(gè)位點(diǎn)位于CD4結(jié)合區(qū)的loop D區(qū)(F277, D279), CD4 binding Loop區(qū)(D368, E370)。
　　綜合針對(duì)Y498的抗病毒活性和機(jī)制研究，我們得出結(jié)論:Y498抗體對(duì)HIV-1不同亞型抗