CD4+NKG2D+T細(xì)胞在NOD鼠T1D中的作用機(jī)制研究.pdf

1、Ⅰ型糖尿病(type1 diabetes mellitus，T1D)是一種自身反應(yīng)性T細(xì)胞攻擊自身胰島β細(xì)胞使其受損的一種自身免疫性疾病。它主要是以效應(yīng)性的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞為主導(dǎo)，其他多種免疫細(xì)胞共同參與而形成的。NKG2D為NK細(xì)胞活化性受體，近來研究發(fā)現(xiàn)亦可表達(dá)于人NKT，γδT，激活的巨噬細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞亞群，CD8+T細(xì)胞;鼠的NKT，γδT細(xì)胞亞群，激活的CD8+T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞亞群。
　　有研究

2、表明，Ⅰ型糖尿病的動物模型NOD鼠的胰島β細(xì)胞表達(dá)NKG2D的配體Rae-1，因此產(chǎn)生了大量表達(dá)NKG2D受體的自身反應(yīng)性CD8+T、CD4+T細(xì)胞浸潤在胰島中。為進(jìn)一步探討CD4+NKG2D+T細(xì)胞參與NOD鼠T1D的發(fā)病機(jī)制，本課題對發(fā)病前驅(qū)期，發(fā)病期以及免疫干預(yù)后的NOD鼠外周血中該群細(xì)胞的表型特征、功能及活化狀態(tài)進(jìn)行研究。本研究內(nèi)容分為三部分:
　　第一部分:NOD鼠CD4+NKG2D+T細(xì)胞頻率與Ⅰ型糖尿病疾病進(jìn)程正相關(guān)

3、
　　目的:觀察NOD鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細(xì)胞在Ⅰ型糖尿病疾病進(jìn)程中頻率變化，探索NOD鼠體內(nèi)該群細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞間關(guān)系。
　　方法:動態(tài)監(jiān)測NOD鼠(n=24)、Ba1b/c鼠(n=24)外周血中CD4+NKG2D+T及CD8+NKG2D+T細(xì)胞在不同周齡的頻率。進(jìn)而利用可有效降低血糖及發(fā)病率的偶聯(lián)皂草素IGRP206-214dtSCT四聚體體內(nèi)靶向清除抗原特異性清除CTL的NOD鼠(n=12)，對其CD4+N

4、KG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率進(jìn)行分析。將所得各個周齡CD4+NKG2D+T及CD8+NKG2D+T細(xì)胞頻率做線性回歸分析。
　　結(jié)果:NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率隨著T1D疾病進(jìn)程發(fā)展而顯著升高。而同周齡的Ba1b/c鼠外周血中的CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率幾乎無變化。偶聯(lián)皂草素體內(nèi)特異性C

5、TL清除的NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T細(xì)胞頻率隨著CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率降低而降低，并且二者之間呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:NOD鼠體內(nèi)存在著一群與Ⅰ型糖尿病相關(guān)的頻率增高的CD4+NKG2D+T細(xì)胞，并且該群細(xì)胞與其體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞之間呈正相關(guān)。
　　第二部分:NOD鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細(xì)胞生物學(xué)特性分析
　　目的:分析并對比處于Ⅰ型糖尿病發(fā)病前驅(qū)期以及發(fā)病期NOD鼠體內(nèi)CD

6、4+NKG2D+T細(xì)胞的功能特性、表型特征、活化狀態(tài)。在體外初步探究該群細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系。
　　方法:通過流式細(xì)胞術(shù)分別檢測處于發(fā)病前驅(qū)期(n=18)及發(fā)病期(n=18)的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細(xì)胞表面CD107A、FasL、CD44、CD62L、CD69、CD25表達(dá)情況，以及胞內(nèi)染色法分析IFN-γ、RORγt、IL-17A、Perforin、granzyme B、TGF-β、IL-10分

7、泌情況。比較NOD鼠體內(nèi)該群細(xì)胞處于Ⅰ型糖尿病兩種不同疾病階段，CD4+NKG2D+T細(xì)胞功能、表型特點(diǎn)及活化狀態(tài)的差異。采用磁珠分選的方法獲取純凈的CD4+NKG2D+T、CD4+NKG2D-T以及CD8+T細(xì)胞，將所得的發(fā)病前驅(qū)期NOD鼠脾臟中的CD4+NKG2D+T細(xì)胞分別與經(jīng)CFSE標(biāo)記的CD4+NKG2DT細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)。4天后檢測體系中的CD4+NKG2D-T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞CFSE的熒光強(qiáng)度變化情況。

8、>　　結(jié)果:發(fā)病期NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細(xì)胞IFN-γ分泌較發(fā)病前驅(qū)期無變化。RORγt的表達(dá)較發(fā)病前驅(qū)期顯著上升，IL-17A的分泌水平亦升高。代表細(xì)胞毒活性的CD107A、顆粒酶B(granzyme B)和穿孔素(Perforin)均無明顯變化。發(fā)病期NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細(xì)胞表達(dá)FasL頻率較發(fā)病前驅(qū)期稍有上升但變化不明顯，TGF-β和IL-10亦是稍有升高，但個體差異比較大的原因使得它們之間沒有統(tǒng)

9、計學(xué)意義。發(fā)病期的NOD鼠外周血中的該群細(xì)胞較CD4+NKG2D-T細(xì)胞，效應(yīng)記憶性T細(xì)胞的頻率較多，而中樞記憶性T細(xì)胞與CD4+NKG2D-T細(xì)胞相比則略有提升，二者之間初始T細(xì)胞頻率雖稍有上升但亦無統(tǒng)計學(xué)差異。發(fā)病期的NOD鼠外周血中的該群細(xì)胞較CD4+NKG2D-T細(xì)胞，CD69表達(dá)頻率升高，CD25表達(dá)頻率亦顯著上升。將磁珠分選所得的CD4+NKG2D+T和CD4+NKG2D-T細(xì)胞共培養(yǎng)4天，與單獨(dú)的CD4+NKG2D-T細(xì)胞

10、相比，加入CD4+NKG2D+T細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，其CD4+NKG2D-T細(xì)胞的增殖加快。而CD8+T的增殖則無變化。
　　結(jié)論:NOD鼠從Ⅰ型糖尿病發(fā)病前驅(qū)期至發(fā)病期之間，其外周血中的CD4+NKG2D+T細(xì)胞不僅頻率有所提高，而且該群細(xì)胞的活化程度也有一定幅度的增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到發(fā)病期的時候，該群由最初的初始細(xì)胞占主導(dǎo)向效應(yīng)記憶型細(xì)胞占主導(dǎo)轉(zhuǎn)變，而功能上的最大改變就是，其RORγt的表達(dá)及IL-17的分泌顯著提高，表明這群CD4+N

11、KG2D+T細(xì)胞可能向CD4+NKG2D+IL-17+T細(xì)胞方向分化。在NOD鼠體內(nèi)，該群CD4+NKG2D+T細(xì)胞是一群高表達(dá)IL-17，高度活化的，效應(yīng)記憶型炎癥性的CD4+T細(xì)胞。
　　第三部分:過表達(dá)mInsB15-23H-2Kd對NOD鼠CD4+NKG2D+T細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　目的:動態(tài)檢測mInsB15-23H-2Kddtsct真核表達(dá)載體干預(yù)后NOD鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細(xì)胞頻率，并對該群細(xì)胞的功

12、能特點(diǎn)，表型特點(diǎn)，活化狀態(tài)進(jìn)行進(jìn)一步研究。在體外探索免疫干預(yù)后的該群細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞及CD4+NKG2D-T細(xì)胞間作用關(guān)系。
　　方法:在NOD鼠3周齡行皮下接種mInsB15-23H-2Kd-SCT真核表達(dá)載體(n=18)，以空載體(n=18)及自然NOD鼠(n=18)為對照。在4、5周齡時分別加強(qiáng)一次。在第三次注射后0、1、12、24、48、72h以及1、3、6、9W取小鼠外周血檢測DC(CD11c+)表面H-2Kd表達(dá)情

13、況。動態(tài)監(jiān)測過表達(dá)mInsB15-23H-2Kd的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率。在20W時，取過表達(dá)的NOD鼠外周血，對其CD4+NKG2D+T細(xì)胞表面CD107A、FasL、CD44、CD62L、CD69、CD25表達(dá)情況，以及胞內(nèi)IFN-γ、RORγt、IL-17A、Perforin、grarzyme B、TGF-β、IL-10分泌情況進(jìn)行分析。并與發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期NO

14、D鼠相比較。采用磁珠分選的方法，從免疫的NOD鼠脾臟獲取的純凈CD4+NKG2D+T細(xì)胞分別與經(jīng)CFSE標(biāo)記的純凈的CD4+NKG2D-T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)。4天后檢測體系中的CD4+NKG2D-T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞CFSE的熒光強(qiáng)度變化情況。
　　結(jié)果:與對照組相比，在第三次注射后的0至72h以及1W之內(nèi)，DC表面H-2Kd的表達(dá)均顯著升高且明顯高于對照組。然而在第三次注射后的3W, DC表面H-2Kd的表達(dá)驟然降低，

15、并持續(xù)低于對照組。CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞在6、8W時顯著高于對照組，10W時二者幾乎持平，12W以后一直低于對照組。在6、8、10W時，真核表達(dá)載體組CD4+NKG2D+T顯著高于對照組，12W時幾乎持平，14W之后一直低于對照組。過表達(dá)mInsB15-23H-2Kd的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細(xì)胞IFN-γ分泌變化不明顯:在8、10W時高于對照組，12W時與對照組幾乎持平，16W以后一直保持在略低于對照組的水

16、平。20W過表達(dá)組較未處理的發(fā)病前驅(qū)期稍有降低，但由于個體差異導(dǎo)致的方差較大，從而導(dǎo)致與發(fā)病期相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義。過表達(dá)mInsB15-23H-2Kd的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細(xì)胞RORγt及IL-17A變化趨勢一致。在8、10W時RORγt的表達(dá)高于對照組，12W時與對照組幾乎持平，16W以后一直保持在略低于對照組的水平。將20W數(shù)據(jù)與發(fā)病前驅(qū)期及發(fā)病期相應(yīng)周齡數(shù)據(jù)對比，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)組較未處理的發(fā)病前驅(qū)期稍有降低，與發(fā)病期

17、相比顯著降低。過表達(dá)的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細(xì)胞IL-17A的分泌在8、10、12W時高于對照組，16W以后一直保持在略低于對照組的水平。20W的過表達(dá)的NOD鼠較未處理的發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期均顯著降低。過表達(dá)的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細(xì)胞表達(dá)CD107A頻率較發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期均無明顯變化。而胞漿內(nèi)顆粒酶B(granzyme B)較發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期均顯著降低。穿孔素（Perforin）較發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期

18、亦顯著降低。過表達(dá)的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細(xì)胞表達(dá)FASL頻率較發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期均無明顯變化。而TGF-β較發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期均顯著升高。IL-10較發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期亦顯著升高。較CD4+NKG2D-T細(xì)胞，效應(yīng)記憶性T細(xì)胞的頻率較多，中樞記憶性T細(xì)胞與CD4+NKG2D-T細(xì)胞相比則略有提升。而初始T細(xì)胞頻率則較CD4+NKG2D-T細(xì)胞明顯減少。過表達(dá)的NOD鼠外周血中的該群細(xì)胞較發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期，CD69表達(dá)

19、頻率均升高，CD25表達(dá)頻率較發(fā)病前驅(qū)期顯著上升，與發(fā)病期幾乎持平。與單獨(dú)的CD8+T細(xì)胞相比，加入CD4+NKG2D+T細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，其CD8+T細(xì)胞增殖加快。而CD4+NKG2D-T細(xì)胞增殖則無明顯變化。
　　結(jié)論:過表達(dá)mInsB15-23H-2Kd的NOD鼠外周血中的CD4+NKG2D+T細(xì)胞不僅頻率較空載體組及NOD鼠有所降低，該群細(xì)胞的活化程度也有一定幅度的增強(qiáng)，并且主要以效應(yīng)記憶型細(xì)胞占多數(shù)。而功能上的最大改變就