哮喘小鼠中CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用機制研究.pdf

1、研究背景:支氣管哮喘是一種世界性疾病。近年來,此病發(fā)病率有逐漸增多的趨勢。據(jù)WHO報道,在全世界范圍中,哮喘相關(guān)的經(jīng)濟花費比結(jié)核病和艾滋病的總數(shù)還高,并預(yù)測2025年將會出現(xiàn)1億例新的哮喘病患者。哮喘病將帶給各國政府、家庭及患者十分沉重的負(fù)擔(dān)。
　　 支氣管哮喘是由多種細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)和其分泌的炎癥介質(zhì)參與的氣道慢性炎癥性疾病。支氣管痙攣、黏膜水腫、氣道分泌物增加、氣道高反應(yīng)是哮喘患者急

2、性發(fā)作的重要特征。由于哮喘對人類的嚴(yán)重危害,醫(yī)學(xué)上從各個角度對哮喘進(jìn)行了研究,尤其免疫學(xué)方面的研究已經(jīng)成為熱點,并已取得許多進(jìn)展。哮喘的發(fā)病機制極為復(fù)雜,迄今尚未闡明,現(xiàn)被較多學(xué)者接受的理論是氣道慢性炎癥學(xué)說。
　　 10余年來,許多學(xué)者對CD4+T淋巴細(xì)胞在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中的作用已經(jīng)有了較深入的認(rèn)識,認(rèn)為Th1/Th2失衡理論在研究哮喘發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用,Th2功能增強、Th1功能抑制可導(dǎo)致哮喘的發(fā)生。但是,近年來從哮

3、喘臨床現(xiàn)象和有關(guān)動物實驗發(fā)現(xiàn),并不能完全用Th1/Th2失衡理論來解釋哮喘的發(fā)病機理。目前,免疫學(xué)上認(rèn)為,哮喘的發(fā)生主要是由于機體免疫耐受功能受損,導(dǎo)致免疫細(xì)胞及其成分對自身組織結(jié)構(gòu)和功能平衡的破壞。近幾年研究也表明,調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞與哮喘炎癥和其在外周維持機體自身免疫耐受可能有著密切的關(guān)系。T細(xì)胞在受到特異性抗原刺激后,并在細(xì)胞因子誘導(dǎo)下可以具有調(diào)節(jié)性的功能特征,即調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Tregs),Tregs涉及抗感染免疫、腫瘤免疫、移

4、植免疫、變態(tài)反應(yīng)等許多病理性免疫過程,對維持機體免疫自穩(wěn)、防止自身免疫病具有極其重要的作用。目前已發(fā)現(xiàn)各種Tregs亞群,包括了CD4+Treg細(xì)胞、Th3細(xì)胞、Treg1細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、Th17細(xì)胞和CD8+Treg細(xì)胞等。CD+Treg是研究較多的調(diào)節(jié)細(xì)胞,它特異性的表達(dá)Foxp3,即CD4*CD25highFoxp3+Treg細(xì)胞。大量研究證實,CD4+CD25+T。細(xì)胞在維持免疫耐受中起著關(guān)鍵性作用。在哮喘的發(fā)病中也

5、起著重要的調(diào)節(jié)作用,它可以抑制Th2型反應(yīng)及嗜酸粒細(xì)胞增多,抑制哮喘發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者體內(nèi)CD4+Treg細(xì)胞數(shù)量下降,功能減低。從體外向哮喘模型動物體內(nèi)輸入CD4+Treg可減輕氣道高反應(yīng)性、嗜酸粒細(xì)胞浸潤和Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。國外學(xué)者報道,Tregs具有抑制哮喘發(fā)作及過敏原對機體產(chǎn)生的遲發(fā)性過敏反應(yīng)。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)Tregs中CD8+Treg的作用尤為重要,在過敏性反應(yīng)中CD4+Treg誘導(dǎo)抑制作用的發(fā)生,而CD8+T

6、reg是發(fā)揮抑制作用的效應(yīng)細(xì)胞。
　　 CD8+D28-T細(xì)胞是近年來證實的另一種重要的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,是CD8+Treg的主要表型之一,Filaci等人經(jīng)表型分析發(fā)現(xiàn)90％以上的CD8+抑制性T淋巴細(xì)胞(現(xiàn)習(xí)慣稱為CD8+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞)為CD28-,缺乏CD28表達(dá)的CD8+CD28-T細(xì)胞同CD4+CD25+T細(xì)胞一樣,具有免疫抑制作用。有研究報道CD8+CD28-T細(xì)胞在人類腫埔中通常存在并發(fā)揮著重要作用,它們既能抑制T

7、細(xì)胞增殖又能抑制其細(xì)胞毒性；CD8+CD28-T細(xì)胞有參與免疫耐受的證據(jù),并且此細(xì)胞升高往往與移植器官功能良好、免疫耐受的出現(xiàn)等呈現(xiàn)正相關(guān),研究顯示CD8+CD28-T細(xì)胞的出現(xiàn)可以作為評價耐受是否出現(xiàn)的一個指征。但是,CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在生理及各種病理條件下,通過不同的機制調(diào)節(jié)著機體的免疫能力,并且在一定的條件下具有細(xì)胞毒的活性,據(jù)文獻(xiàn)報道巨細(xì)胞病毒,EB病毒,帶狀皰疹病毒感染時可誘導(dǎo)出CD8+CD28-T細(xì)胞介導(dǎo)病毒特異性的溶細(xì)胞

8、的活性,由此說明在病毒感染中CD8+CD28-T細(xì)胞具有細(xì)胞毒的活性。Hamzaoui等人研究發(fā)現(xiàn)重癥及輕者哮喘患者痰中CD8+CD28-T細(xì)胞較正常人痰中明顯增多。有研究表明CD8+Treg能否抑制遲發(fā)性過敏反應(yīng)與CD94/NKG2A受體密切相關(guān),以及CD8+CD28-T細(xì)胞需依靠IL-10、IFN-γ、IL-6等細(xì)胞因子而發(fā)揮抑制功能。然而,目前對于哮喘中CD8+CD28-T細(xì)胞的是否有免疫抑制的作用及有關(guān)機制研究甚少。
　　

9、 我們通過建立哮喘模型,檢測哮喘小鼠外周血、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的CD8+CD28-T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比,用地塞米松治療哮喘小鼠后CD8+CD28-T細(xì)胞百分比的變化,分析哮喘組外周血中CD8+CD28-T細(xì)胞百分比分別與氣道內(nèi)細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞數(shù)、IgE、IFN—γ的相關(guān)系,以探討CD8+CD28-T細(xì)胞在哮喘發(fā)病機制中的作用及在治療哮喘時地塞米松對此細(xì)胞的影響。檢測小鼠肺組織中NKG2A的表達(dá),探討哮喘小鼠中CD8

10、+Treg細(xì)胞是否能發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。
　　 第一部分:哮喘動物模型的建立及驗證
　　 目的:建立OVA致敏和激發(fā)的BALB/c小鼠哮喘模型
　　 方法:雌性BALB/c小鼠30只,4—6周齡,體重18～20g,由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,隨機分為3組,每組10只,哮喘組(A組),地塞米松組(D組),正常對照組(C組)。A組、D組小鼠于實驗流程的第0d、14d給予腹腔注射含OVA與乳化的氫氧化鋁及生理鹽水混懸液2

11、00μl致敏,C組僅用含乳化的氫氧化鋁混懸液200μl。A組小鼠于實驗第21d起先給予1％OVA滴鼻液100μl滴鼻激發(fā),隨后接著給予2％OVA霧化液40ml,經(jīng)超聲霧化器霧化吸入,1次/d,每次持續(xù)約30min,連續(xù)6d。D組小鼠于實驗第21d起先給予地塞米松1mg/kg,30分鐘后接著行1％OVA滴鼻液100μl滴鼻,再給予2％OVA霧化液40ml霧化吸入。C組以生理鹽水代替地塞米松注射液、滴鼻液、霧化液,方法同D組。每組小鼠以末次

12、激發(fā)24h后,隨機抽取3只小鼠,通過小鼠無創(chuàng)肺功能儀測定小鼠的氣道反應(yīng)性,測定倍增濃度的Mch500ul(0,3.125,6.25,12.5,25,50,100mg/ml)相應(yīng)濃度下的增強呼吸間歇值(以下稱Penh值)。剩余的小鼠以末次激發(fā)48h后摘取小鼠眼球放血后,開胸結(jié)扎右主支氣管行支氣管肺泡灌洗術(shù),將外周血和回收過濾后的BALF,離心取上清液-20℃保存?zhèn)溆?BALF沉淀細(xì)胞在顯微鏡下行細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞(EOS)計數(shù)；取右肺組

13、織作HE染色病理切片,光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)、氣道上皮損傷,氣管及血管周圍嗜酸粒細(xì)胞浸潤情況。取外周血上清液、BALF上清液,根據(jù)小鼠IgE ELISE試劑盒的使用說明書測量小鼠外周血、BALF中IgE含量。
　　 結(jié)果
　　 1.致敏及激發(fā)過程中小鼠行為學(xué)觀察:A組、D組在第二次致敏15min后出現(xiàn)不同程度的呼吸急促,口唇、耳、尾巴黏膜發(fā)紫,立毛,趴在原地,活躍明顯減低,整過程約持續(xù)2-3小時；C組小鼠未出現(xiàn)呼吸急促

14、、紫紺等表現(xiàn)。A、D組小鼠在霧化激發(fā)后出現(xiàn)不同程度的頭面部瘙癢,前肢搔鼻,煩燥不安,口唇紫紺,扭體反應(yīng)等癥狀,而C組無明顯上述癥狀。
　　 2.小鼠無創(chuàng)肺功能檢測結(jié)果:隨著Mch濃度的增加,A組、D組的Penh值逐漸增加,A組、D組于Mch濃度>6.25mg/ml開始,各Penh值均明顯高于C組,p<0.05；A組與D組的Penh值相比較,A組高于D組,但僅在Mch濃度為6.25,12.5mg/ml時有統(tǒng)計學(xué)差異,兩者P<0.0

15、1,其它濃度下Penh值無顯著差異。
　　 3.BALF中細(xì)胞總數(shù)及EOS的變化:A組BALF中的細(xì)胞總數(shù),EOS(4.89±3.49,1.75±0.75)105/ml較C組(0.91±0.64,P=0.003；0.30±0.16,P=0.000)增多。D組的BALF中的細(xì)胞總數(shù)(2.11±1.22)105/ml較A組減少,P=0.027,但與C組比較無統(tǒng)計學(xué)意義,P=0.314；D組的BALF中的EOS(1.04±0.53)1

16、05/ml較C組增多,P=0.020；較A組減少,有統(tǒng)計學(xué)差異,P=0.024。
　　 4.小鼠肺組織的病理變化:A組、D組中支氣管、血管周圍,肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)可見嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤,氣道上皮損傷,結(jié)構(gòu)紊亂,氣道內(nèi)杯狀細(xì)胞肥大增生,分泌大量黏液并有粘液栓形成,A組較D組嚴(yán)重。C組肺組織氣道結(jié)構(gòu)清晰,氣道纖毛上皮排列整齊,無明顯的炎癥改變。
　　 5.外周血、BALF中IgE含量變化:A組、D組的血清IgE含量(3

17、7.47±6.18、25.93±2.71)ug·ml-1較C組(18.16±4.45)ug·ml-1增多,P=0.000,P=0.006,均有顯著性差異；D組較A組減少,P=0.000。A組、D組的BALF中IgE含量(26.10±7.18、13.57±2.11)ug·ml-1較C組(6.71±1.23)ug·ml-1增多,P=0.001,P=0.000,均有統(tǒng)計學(xué)意義；D組較A組減少,有統(tǒng)計學(xué)差異,P=0.008。結(jié)論:根據(jù)不同組間小

18、鼠的癥狀體征,再結(jié)合氣道內(nèi)細(xì)胞總數(shù)、EOS、活體肺功能、腫組織病理、IgE的情況,證明OVA致敏和激發(fā)的BALB/c小鼠哮喘模型建立成功。哮喘小鼠經(jīng)地塞米松1mg/kg治療后可減輕氣道炎癥,緩解氣道高反應(yīng)性,緩解哮喘癥狀。
　　 第二部分:哮喘小鼠中CD8+CD28-T細(xì)胞的觀察及地塞米松對其干預(yù)影響
　　 目的:探討CD8+CD28-T細(xì)胞在哮喘發(fā)病機制中的作用及用地塞米松治療哮喘時此細(xì)胞是否受影響。
　　 方

19、法:雌性BALB/c小鼠21只,4—6周齡,體重18～20g,由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,隨機分為3組,每組7只,A為哮喘組,D為地塞米松組,C為正常對照組。哮喘模型的制作方法及過程同第一部分內(nèi)容。于末次霧化激發(fā)48h后,摘取小鼠眼球放血,置于肝素鈉抗凝管內(nèi),接著開胸結(jié)扎右主支氣管后行支氣管肺泡灌洗術(shù),回收BALF。取右肺肺組織置于4％多聚甲醛中固定。BALF離心后,上清液-20℃保存?zhèn)溆?而細(xì)胞沉淀,用PBS重懸?；厥盏腂ALF細(xì)

20、胞懸液及抗凝血均置于4℃保存,備以流式細(xì)胞儀檢測CD8+CD28-T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比,當(dāng)天8h內(nèi)測完。部分BALF細(xì)胞懸液行細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞數(shù)(EOS)。根據(jù)小鼠IFN—γ、IgE ELISE試劑盒使用說明書檢測BALF中IFN—γ、IgE含量；分析哮喘組BALF中細(xì)胞總數(shù)、EOS、IFN—γ、IgE分別與外周血中CD8+CD28-T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比的相關(guān)性。
　　 結(jié)果
　　 1.致敏及激發(fā)過程中小鼠行為

21、學(xué)觀察:同第一部分。
　　 2.BALF中細(xì)胞總數(shù)及EOS的變化:A組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、EOS(5.56±4.06、3.29±2.23)105/ml均較C組(0.91±0.65,P=0.003、0.43±0.37,P=0.001)明顯增多:D組BALF中的細(xì)胞總數(shù)、EOS(2.59±1.69、1.11±0.73)105/ml均較A組減少,P=0.044,P=0.008；D組BALF中的細(xì)胞總數(shù)和EOS與C組相比,均無統(tǒng)計學(xué)

22、意義,P=0.234,P=0.363。
　　 3.小鼠肺組織的病理變化:A組、D組肺組織病理切片見支氣管、血管周圍,肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)可見嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤,氣道上皮損傷,結(jié)構(gòu)紊亂,氣道內(nèi)杯狀細(xì)胞肥大增生,分泌大量黏液并有粘液栓形成,A組較D組嚴(yán)重。C組肺組織氣道結(jié)構(gòu)清晰,氣道纖毛上皮排列整齊,無明顯的炎癥改變。
　　 4.BALF中IFN-γ含量變化:A組、D組的BALF中IFN-γ含量(37.44±21.01、

23、77.35±37.71)ng·L-1,較C組(130.88±32.23)ng·L-1減少,有顯著差異性,P=0.000,P=0.005。D組較A組多,P=0.027,有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 5.BALF中IgE含量變化:A組、D組的BALF中IgE含量(23.84±5.97、13.15±2.22)ug·ml-1較C組(6.13±1.03)ug·ml-1增多,P=0.001、P=0.000,均有統(tǒng)計學(xué)意義:D組較A組減少,P=0.0

24、07,有顯著性差異。
　　 6.外周血、BALF中CD8+CD28-T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比結(jié)果:A組、D組外周血中CD8+CD28-T細(xì)胞的百分比(18.68±4.12、13.43±2.90)％均明顯較C組(8.43±4.60)％增多,P=0.000、P=0.029,均有統(tǒng)計學(xué)意義；D組外周血中C08+CD28-T細(xì)胞百分比較A組減少,P=0.023,有統(tǒng)計學(xué)差異。A組、D組BALE中CD8+CD28-T細(xì)胞的百分比(1.25

25、±0.40、0.66±0.49)％均明顯較C組(0.21±0.19)增多,P=0.000、P=0.041,均有統(tǒng)計學(xué)意義；D組BALE中CD8+CD28-T細(xì)胞百分比較A組減少,有統(tǒng)計學(xué)差異,P=0.010。
　　 7.哮喘組Pearson相關(guān)分析結(jié)果:A組BALE中細(xì)胞總數(shù)與其血中CD8+CD28-T細(xì)胞百分比成顯著正相關(guān)(r=0.806,P=0.029)；BALE中EOS與血中CD8+CD28-T細(xì)胞百分比成顯著正相關(guān)(r=

26、0.804,P=0.029)；BALF中IgE與血中CD8+CD28-T細(xì)胞百分比成顯著正相關(guān)(r=0.864,P=0.012)；BALF中IFN—γ與血中CD8+CD28-T細(xì)胞百分比不成在相關(guān)性(r=0.124,P=0.792),無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:CD8+D28-T細(xì)胞的增多與哮喘小鼠氣道炎癥發(fā)生有明顯相關(guān)性,可能是哮喘發(fā)病重要因素之一,地塞米松可有效抑制哮喘氣道炎癥,并有可能通過抑制CD8+CD28-T細(xì)胞的表達(dá)

27、和功能而減輕哮喘的癥狀。
　　 第三部分:哮喘小鼠中CD8+Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié)機制研究
　　 目的:檢測小鼠肺組織中NKG2A的表達(dá),以探討在哮喘小鼠中CD8+Treg細(xì)胞是否能正常發(fā)揮其抑制調(diào)節(jié)功能。
　　 方法:雌性BALB/c小鼠21只,4—6周齡,體重18～20g,由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,隨機分為3組,每組7只,A為哮喘組,D為地塞米松組,C為正常對照組。哮喘模型的制作方法及過程同第二部分內(nèi)容。由

28、第二部分取得的肺組織,置于4％多聚甲醛溶液中固定,常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、制備石蠟切片。石蠟切片經(jīng)脫蠟,水化,抗原修復(fù),加對應(yīng)的Ⅰ、Ⅱ抗體,顯色,脫水,封片,鏡檢。NKG2A表達(dá)以染色呈棕黃色為陽性,光鏡下觀察,所有切片放大倍數(shù)為400倍。NKG2A的表達(dá)每張切片觀察6個視野,免疫組化結(jié)果采用Imaga—ProPlus6.0軟件分析以單個視野下平均光密度,以IOD強度來表示NKG2A表達(dá)高低。
　　 結(jié)果:A組、D組肺組織表達(dá)