GSK3β在TNAP缺乏導致的牙硬組織礦化異常中的作用.pdf

1、低堿性磷酸酯酶癥（Hypophosphatasia，HPP）是一種罕見的系統(tǒng)性遺傳疾病。主要由于 ALPL基因突變導致組織非特異性堿性磷酸酶（TNAP）活性降低從而引起骨和牙礦化代謝的異常。TNAP在骨與牙等硬組織的礦化過程中具有重要作用。最新研究表明，TNAP缺乏不僅僅會直接抑制礦化過程，還可能通過微環(huán)境影響相關間充質干細胞的生物學特性。間充質干細胞及其微環(huán)境是維持相關組織正常發(fā)育的重要基礎，且在組織更新和修復過程中發(fā)揮著重要作用。在

2、基因缺陷情況下干細胞表現出的細胞生物學行為將直接關系到患者的臨床表現。
　　本課題組前期研究發(fā)現，來源于HPP患兒的骨髓間充質干細胞（BMMSC）存在分化能力異常，同時Active-β-catenin表達降低，提示Wnt/β-catenin信號通路可能參與了低ALP活性條件下干細胞功能的改變。但與牙齒發(fā)育礦化密切相關的牙髓干細胞（DPSC）及牙周膜干細胞(PDLSC)，其在ALPL基因異常情況下功能的改變尚未見報道。
　　本

3、實驗擬研究DPSC和PDLSC在TNAP缺乏時的功能改變以及相關機制，在此基礎上，初步探索利用恢復干細胞功能來治療HPP相關異常的可能性。
　　研究主要由以下幾個方面逐步進行：第一，以ALPL基因敲除小鼠Akp2+/-為模型，觀察敲除 ALPL基因對牙齒硬組織的影響；第二，通過慢病毒轉染的方法敲減正常人來源的hPDLSC與hDPSC中的ALPL基因，觀察敲減ALPL基因對干細胞功能的影響，同時檢測GSK3β及相關信號通路的變化；第

4、三，觀察GSK3β磷酸化抑制劑LiCl對ALPL基因敲減后hPDLSC與hDPSC功能的影響；第四，觀察 LiCl對 Akp2+/-小鼠牙及牙槽骨異常的恢復作用，以此驗證 GSK3β及間充質干細胞在TNAP功能異常導致的牙硬組織礦化異常中的作用。
　　第一部分 ALPL基因敲除對小鼠牙硬組織的影響
　　研究目的：
　　觀察ALPL基因敲除對小鼠牙及牙槽骨的影響。
　　研究方法：
　?。?）Micro-CT掃

5、描野生型與Akp2+/-小鼠單側下頜骨，觀察Akp2+/-小鼠牙及牙槽骨的改變；選取第一磨牙冠部牙本質進行組織礦化密度定量分析。
　?。?）掃描電鏡觀察野生型與Akp2+/-小鼠牙本質的礦化情況。
　　研究結果：
　?。?）Micro-CT觀察，比較于野生型，Akp2+/-小鼠的頜骨及牙槽骨存在明顯缺損，牙齒牙髓腔擴大；
　?。?）電鏡掃描結果可見，與野生型比較，Akp2+/-小鼠牙本質礦化程度低，可見膠原纖維暴

6、露。
　　結論：
　　相比較于野生型小鼠，Akp2+/-小鼠存在不同程度的牙槽骨缺損以及牙本質礦化不全。
　　第二部分 ALPL基因敲減對hPDLSC與hDPSC干細胞功能的影響
　　研究目的：
　　驗證ALPL基因突變對hPDLSC和hDPSC干細胞功能的影響。
　　研究方法：
　?。?）體外培養(yǎng)正常人來源 hPDLSC與 hDPSC，通過慢病毒轉染的方法敲減hPDLSC和hDPSC中的ALP

7、L基因；在此基礎上用Western-Blot和茜素紅染色法檢測敲減后hPDLSC和hDPSC成骨能力的改變；
　?。?）Western-Blot檢測敲減后hPDLSC與hDPSC中的P-GSK3β表達。
　　研究結果：
　　（1）Western-Blot結果可見，ALPL敲減后，hPDLSC與hDPSC中ALP蛋白表達量下降，其它成骨相關蛋白表達均下降；hDPSC中DSP表達下降。
　?。?）敲減ALPL后，茜素

8、紅染色結果可見hPDLSC與hDPSC成骨能力下降。
　　（3）敲減ALPL后，Western-Blot結果可見hPDLSC與hDPSC中P-GSK3β表達量下降。
　　結論：
　?。?）通過慢病毒轉染法可以有效地敲減hPDLSC與hDPSC中的ALPL基因，并且在敲減后，hPDLSC與hDPSC的成骨能力受到抑制；
　?。?）在敲減ALPL后，hPDLSC與hDPSC中P-GSK3β表達下降，提示Wnt信號通路

9、受到抑制。
　　第三部分 GSK3β抑制劑對ALPL敲減hPDLSC與hDPSC功能的影響
　　研究目的：
　　觀察LiCl對ALPL敲減hPDLSC與hDPSC成骨能力的影響，驗證GSK3β在ALPL基因突變導致的干細胞功能異常中的作用。
　　研究方法
　　成骨誘導ALPL敲減后的hPDLSC和hDPSC，在誘導過程中加入GSK3β抑制劑LiCl；成骨誘導21d時，茜素紅染色觀察其成骨能力的改變。

10、　　研究結果：
　　茜素紅染色結果可見，在成骨誘導過程中加入LiCl后，hPDLSC與hDPSC成骨能力明顯提高。
　　結論：
　　在成骨誘導過程中通過抑制GSK3β而激活 Wnt信號通路，可以使 ALPL敲減hPDLSC和hDPSC的成骨能力提高，驗證了ALPL基因突變是通過GSK3β影響干細胞的成骨能力。
　　第四部分GSK3β抑制劑對于Akp2+/-小鼠牙硬組織異常的作用
　　研究目的：
　　觀

11、察LiCl對Akp2+/-小鼠牙硬組織異常的作用
　　研究方法：
　　對Akp2+/-小鼠注射LiCl（100mg/Kg），與Akp2+/-小鼠作比較，應用Micro-CT和掃描電鏡觀察注射后牙槽骨缺損以及牙本質礦化程度的變化。
　　研究結果：
　?。?）Micro-CT結果可見，比較與對照組，注射組小鼠牙槽骨缺損得到明顯改善；
　?。?）掃描電鏡觀察，注射組小鼠牙本質礦化程度明顯升高。
　　結論：<