Wnt2b對肝細胞癌生物學功能的影響及相關(guān)機制探究.pdf

1、研究目的
　　肝癌是病死率最高的惡性腫瘤之一，也是威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率一直很高。在我國，肝癌的死亡率位列第二、發(fā)病率位列第四。對于肝癌的診斷，主要是對腫瘤標志物的檢測和影像學檢查。對于肝癌的治療的方法有很多，例如手術(shù)切除等。但是，盡管經(jīng)過了有效的治療，肝癌仍然有復發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能。因此，需要進一步闡明肝癌發(fā)生的分子機制，發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)生時有差異的分子和異常的信號通路，尋找有效治療肝癌的新方法，為臨床治療提供新的方向。

2、　　近年來的研究中有學者發(fā)現(xiàn)，在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中有異?；罨男盘柾?。值得我們重視的是，在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中有Wnt經(jīng)典信號通路的活化現(xiàn)象。Wnt信號通路是一條高度保守的信號通路，其在生物體的胚胎發(fā)育，組織修復與再生，調(diào)控生物體內(nèi)與細胞生長、凋亡、自我更新和生存基因的表達發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)所激活信號通路的不同，Wnt信號通路若依賴于β-catenin分子發(fā)揮作用則為經(jīng)典的信號通路;若不依賴，則為非經(jīng)典通路。
　　關(guān)于Wnt

3、與肝臟的研究主要集中于Wnt信號通路在肝纖維化過程中發(fā)揮的作用。研究表明，當經(jīng)典的Wnt信號通路發(fā)生活化時可激活肝星狀細胞而導致肝纖維化。但是，對于Wnt信號通路與肝癌的研究比較少，且目前對于Wnt家族分子的研究主要集中于Wnt3a與Wnt5a。在前期工作中我們發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，病變肝臟中Wnt2b分子呈現(xiàn)高表達趨勢，并且與疾病嚴重程度有一定相關(guān)性。在TLR4促進HCC發(fā)生、TLR2抑制HCC發(fā)生的前提下，我們發(fā)現(xiàn)TLR4激動劑刺

4、激人肝癌細胞系(HepG2，H7702)和鼠肝癌細胞系(Hepa1-6) Wnt2b表達上調(diào)，TLR2激動劑刺激則表達下調(diào)。這些結(jié)果提示我們，在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Wnt2b可能起到關(guān)鍵的作用。根據(jù)上述的實驗現(xiàn)象，本研究在體外實驗中利用分子生物學手段，探討了Wnt2b分子對肝癌細胞的腫瘤生物學特征的影響，并探討相關(guān)機制;并通過體內(nèi)實驗證明，Wnt2b促進小鼠腫瘤的生長，且抑制腫瘤組織中NK細胞的數(shù)量和比例。另外，本研究初步探討了抑制W

5、nt2b的表達輔助治療肝癌的應用，為肝癌的治療提供新的靶點和實驗依據(jù)。
　　研究方法
　　1.以幾種常見的人和鼠肝癌細胞系為模型，采用MTT法、細胞平板克隆實驗檢測TLR2激動劑Pam3CSK4和TLR4激動劑LPS對肝癌細胞增殖能力的影響。
　　2.采用免疫熒光、免疫組化及western blot方法，檢測TLR4對肝癌細胞系和肝癌組織中β-catenin的影響。
　　3.以不同的TLR缺失小鼠為模型，采用半定

6、量RT-PCR法檢測Wnts mRNA的基礎表達水平。采用半定量RT-PCR法，檢測TLR2和TLR4對人肝癌細胞HepG2所有Wnts mRNA水平的影響。
　　4.采用半定量RT-PCR法和western blot，檢測TLR2和TLR4對人肝癌細胞HepG2、H7402和鼠肝癌細胞系Hepa1-6中Wnt2b mRNA的影響。
　　5.采用MTT法檢測Wnt2b對肝癌細胞增殖的影響。采用細胞集落形成方法和Real-ti

7、me PCR探究Wnt2b對肝癌細胞系干性的影響。采用PI單染、AnnexinⅤ/PI雙染法分別檢測Wnt2b分子對肝癌細胞周期和凋亡的影響。
　　6.采用western blot、定量PCR、MTT法檢測Wnt2b對肝癌細胞的作用是否通過活化Wnt信號通路。
　　7.動物實驗采用皮下腫瘤組織荷瘤，細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒并瘤內(nèi)注射的方法觀察Wnt2b對腫瘤的影響，并用流式檢測腫瘤組織和肝臟中淋巴細胞亞群的變化。
　　研究結(jié)果<

8、br>　　1.TLR2抑制肝癌細胞系的增殖，TLR4則促進肝癌細胞系的增殖。TLR2抑制肝癌細胞的干性，TLR4則促進肝癌細胞的干性。
　　2.TLR4促進肝癌細胞系中β-catenin的表達及入核。與TLR4缺失小鼠的肝癌組織相比，WT小鼠肝癌組織中β-catenin表達上調(diào)，且入核β-catenin增多。
　　3.不同TLR缺失小鼠的肝組織中，Wnts的表達不同。TLR2激動劑刺激人肝癌細胞系HepG2，Wnt2分子，W

9、nt2b分子表達下調(diào)。在TLR4激動劑LPS刺激下，Wnt5a分子表達下調(diào)，Wnt2b分子表達上調(diào)。
　　4.TLR2抑制肝癌細胞系中Wnt2b的表達，TLR4促進肝癌細胞系中Wnt2b的表達。
　　5.Wnt2b促進肝癌細胞系的增殖。Wnt2b促進肝癌細胞的干性。Wnt2b抑制肝癌細胞系的凋亡，促進抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1的表達，但不影響肝癌細胞系的周期。
　　6.Wnt2b對肝癌的促進作用是通過活化Wnt/

10、β-catenin信號通路實現(xiàn)的;沉默β-catenin后，Wnt2b則不能發(fā)揮促進肝癌的作用。
　　7.Wnt2b促進腫瘤的生長并通過抑制腫瘤組織中NK細胞的數(shù)量。
　　結(jié)論及意義
　　1本文首次發(fā)現(xiàn)TLR2分子和TLR4分子在肝癌過程中對Wnt2b表達的影響，發(fā)現(xiàn)TLR4分子促進β-catenin的活化，為TLR信號通路與Wnt信號通路建立了聯(lián)系。
　　2首次發(fā)現(xiàn)Wnt2b對肝細胞癌細胞的促進作用，并闡明了其