伊班膦酸鈉對口腔內(nèi)有成骨潛能細胞生物學(xué)功能的影響及microRNA相關(guān)機制初探.pdf

1、20世紀(jì)60年代，瑞典學(xué)者Branemark教授提出“骨整合”(osteointegration)的概念，為口腔種植學(xué)奠定了理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)在，我國的很多口腔醫(yī)院、診所都已經(jīng)開展了口腔種植修復(fù)治療項目，很多的患者通過種植治療完成了各種牙列缺損的修復(fù)。絕大多數(shù)口腔醫(yī)生認同口腔種植修復(fù)是現(xiàn)代口腔臨床醫(yī)療技術(shù)中最先進、同時也是最具有發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)之一。
　　口腔種植修復(fù)與其它口腔修復(fù)治療手段具有相同的治療目的：不僅要求修復(fù)體能夠具有良好的固

2、位性能，更要求修復(fù)體具有良好的抗力效果，也就是說要求修復(fù)體能夠提供足夠的咬合力，行使咀嚼功能；同時，還要求修復(fù)體在外形上滿足患者的美觀要求。要達到上述治療效果的前提是種植體能與周圍骨組織形成良好的骨整合，如何加快骨整合的速度，縮短種植體-骨界面的愈合時間，從而實現(xiàn)種植體的早期抗力甚至于即刻抗力成為現(xiàn)階段口腔種植領(lǐng)域的研究熱點。
　　近年來隨著臨床用藥物的發(fā)展，出現(xiàn)了很多可以促進骨整合的藥物，尤其以近30年來發(fā)展起來的一類新藥——二

3、膦酸鹽類藥物，效果最為顯著。其具有較強的促進成骨和增加種植體-骨接觸率等作用?？谇环N植體因具有其特殊的組織環(huán)境及力學(xué)條件而區(qū)別于其它種植體，尤其要求種植體能夠早期愈合，早期抗力。研究表面含有可促進骨整合藥物的羥基磷灰石涂層口腔種植體，具有極高的臨床應(yīng)用前景、將可以極大的提高口腔種植治療的臨床效果。
　　基于以上原因，在本課題中篩選并鑒定藥物促進口腔有成骨能力的細胞增殖過程中起調(diào)控作用的miRNA分子，驗證這些miRNA分子對成骨細

4、胞增殖分化等功能的調(diào)控作用；選取目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的“三代”二膦酸鹽類藥物——伊班膦酸鈉作為研究對象，通過體外實驗證實伊班膦酸鈉對于口腔有成骨作用的細胞的促增殖，利成骨及促進細胞在鈦膜上粘附、成骨的作用；通過鑒定候選miRNA分子的可能靶基因，明確這些miRNA分子調(diào)節(jié)的信號通路，闡明候選miRNA在伊班膦酸鈉存在時對口腔有成骨能力的細胞功能的影響。本文中的研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.伊班膦酸鈉(Ibandronate)對口

5、腔內(nèi)有成骨能力的細胞生物學(xué)功能的影響。為了驗證Ibandronate對口腔有成骨能力的細胞增殖的影響，我們首先用MTT試驗檢測了Ibandronate在不同濃度下對PDLSC、SHED細胞增殖的影響。結(jié)果表明，Ibandronate以劑量依賴性的方式影響PDLSC和SHED細胞的增殖。當(dāng)Ibandronate在相對較高濃度時，如10-3M時，Ibandronate能夠抑制PDLSC細胞的增殖，當(dāng)Ibandronate濃度在10-6到10

6、-10M濃度范圍內(nèi)時，Ibandronate明顯促進PDLSC細胞的增殖。Ibandronate的濃度在10-8M時，對PDLSC細胞增殖的促進作用最強，與對照相比增幅高達25％。當(dāng)Ibandronate濃度為小于10-11M時，對PDLSC細胞增殖則觀察不到明顯影響。在Ibandronate作用的SHED細胞觀察到了相似的變化。
　　我們用qRT-PCR檢測了成骨相關(guān)基因的表達。ALP，COL-1，osteoprotegerin

7、（OPG），OC和Runx2等成骨相關(guān)基因的表達可以顯示PDLSC細胞的成骨分化狀態(tài)。我們的結(jié)果顯示Ibandronate能夠影響這些基因的表達，其中ALP的表達是成骨分化的一個早期的指標(biāo)。我們分別于10-8M的Ibandronate作用于PDLSC細胞4，8，12和24h后提取總RNA，檢測ALPmRNA水平的表達情況。結(jié)果表明ALP水平在Ibandronate作用后呈現(xiàn)上調(diào)，在8h時達到頂峰。其它影響PDLSC成骨分化狀態(tài)的基因則分

8、別于Ibandronate作用后的12，24，48h進行檢測。結(jié)果，COL-1，OPG，OC和Runx2的mRNA水平也發(fā)生了上調(diào)。
　　2.伊班膦酸鈉能引起成骨細胞miRNA表達譜的改變。為了揭示Ibandronate對microRNA這種功能廣泛的人類基因的小調(diào)控分子的影響，我們首先對近年來發(fā)表的與成骨分化有影響的microRNA分子進行篩選，發(fā)現(xiàn)microRNA中的miR-125b，miR-141，miR-135等分子參與了

9、成骨分化的調(diào)控。然后我們用10-8M的Ibandronate作用于PDLSC，SHED和鼠顱骨原代細胞24h后，采用qRT-PCR方法檢測microRNA分子的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PDLSC細胞，miR-18a和miR-130a被Ibandronate上調(diào)，其它microRNA分子則下調(diào)；在SHED細胞，miR-18a和miR-133a分子表達上調(diào)，其它microRNA分子則下調(diào)；在鼠顱骨原代細胞上調(diào)的分子包括miR-18a，miR-

10、133a，miR-133b，miR-19a，miR-196a，miR-211，miR-200a，miR-200b，這說明Ibandronate作用于有成骨能力的細胞并使其影響microRNA的表達譜發(fā)生改變，進而對其成骨分化過程進行調(diào)控。
　　3.伊班膦酸鈉對有變化的miRNA靶基因的影響。為了進一步揭示伊班膦酸鈉對相關(guān)成骨細胞miRNA靶基因的影響，我們對文獻報道中可能參與成骨分化的microRNA的靶基因進行篩選，最后選取mi

11、R-125b，miR-133，miR-135b，miR-141和miR-26a作為目的靶基因，采用RT-PCR方法對它們的表達水平進行了檢測。結(jié)果表明，這些基因的表達呈現(xiàn)時間依賴性地上調(diào)，其表達與相應(yīng)microRNA分子的表達剛好正反，也印證了microRNA分子可能對這些分子進行mRNA水平的負調(diào)控。
　　4.伊班膦酸鈉對細胞在鈦膜上粘附、成骨的影響。為了證實伊班膦酸鈉對細胞在鈦膜上粘附、成骨功能的影響，我們將PDLSC細胞與4

12、00?！?500＃的不同打磨程度的鈦片或是用40?；?0＃氧化鋁顆粒噴砂處理的鈦片共同孵育，并在系統(tǒng)中加入或不加入Ibandronate，在30min，60min和120min檢測細胞在鈦片上的粘附情況。細胞粘附檢測結(jié)果表明，在細胞接種的早期PDLSC細胞對不同粗糙程度的鈦片表面的粘附程度是不同的，與對照相比，粗糙的鈦片表面更利于PDLSC細胞的粘附，而Ibandronate能夠促進PDLSC細胞在鈦金屬表面的粘附，但120min以后，

13、在不同鈦片表面細胞的粘附率沒有明顯差異。細胞增殖能力檢測結(jié)果表明，鈦片表面的光滑程度對細胞的增殖有一定的影響，光滑表面可能更利于細胞的增殖，而Ibandronate能夠明顯促進細胞在不同鈦片表面的增殖，Ibandronate存在下PDLSC細胞在鈦片表面形成了良好的粘附，細胞充分伸展，有很多絲狀突起，具有旺盛的增殖活性，說明Ibandronate提高了純鈦與PDLSC細胞的生物相容性，促進PDLSC細胞的鋪展。間接免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)，