Hsf4對溶酶體活性的調(diào)控.pdf

1、背景：眼晶狀體蛋白變性形成非透明樣斑塊組織，致使光線不能投射到視網(wǎng)膜形成圖像，這一眼部疾病稱為白內(nèi)障。白內(nèi)障發(fā)病率達(dá)到60％-80%，是導(dǎo)致失明的主要原因，將近50%的失明是由白內(nèi)障引起的。正常情況下，人眼中的晶狀體組織是透明的，光線能夠透過它到達(dá)視網(wǎng)膜，使人們清晰地看到物體。晶狀體由兩種細(xì)胞組成，前囊立方上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞。赤道區(qū)前囊上皮細(xì)胞具有無限增生的能力，并且能持續(xù)向纖維細(xì)胞分化，因此可知晶狀體是一個終生生長的器官。纖維細(xì)胞分為

2、前囊上皮下的皮質(zhì)纖維細(xì)胞和核心區(qū)的終末分化纖維細(xì)胞，終末分化的纖維細(xì)胞能合成大量折疊有序的晶狀體蛋白，并且主動失去細(xì)胞內(nèi)的膜性亞細(xì)胞器（包括細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體等），形成能折射光線的中心透明區(qū)（也稱OFZ，organelle freezone），但纖維細(xì)胞終末分化的去膜性亞細(xì)胞器的機(jī)理還不清楚。有報道發(fā)現(xiàn)溶酶體介導(dǎo)的自噬和泛素-蛋白酶體是調(diào)控去亞細(xì)胞器的主要通路，溶酶體腔內(nèi)的DNaseⅡbeta和水解酶參與晶狀體纖維細(xì)胞核和

3、膜性亞細(xì)胞器的降解，基因敲除DNaseⅡbeta的小鼠晶狀體纖維細(xì)胞脫核障礙，形成非透明的白內(nèi)障。然而，在終末纖維細(xì)胞分化過程中，調(diào)控溶酶體活性的信號通路仍不清楚。熱休克轉(zhuǎn)錄因子4是熱休克轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，該家族轉(zhuǎn)錄因子能感受外界和細(xì)胞內(nèi)源性應(yīng)激刺激，上調(diào)熱休克蛋白家族成員的表達(dá)，后者通過對變性蛋白的復(fù)性、分割和降解，達(dá)到對細(xì)胞生命的保護(hù)，這一過程成為熱休克應(yīng)激反應(yīng)。熱休克轉(zhuǎn)錄因子4主要表達(dá)在晶狀體、脾、心臟和腦組織中。Hsf4基因

4、突變與家族顯性遺傳性白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)，基因敲除Hsf4的小鼠發(fā)生先天性白內(nèi)障，主要表現(xiàn)為出生后小鼠晶狀體纖維細(xì)胞分化障礙，終末分化纖維細(xì)胞脫核延遲。Hsf4主要表達(dá)在晶狀體上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞的核內(nèi)。有報道發(fā)現(xiàn)Hsf4參與調(diào)控DNaseⅡbeta的基因表達(dá)。因此我們推論Hsf4通過調(diào)控纖維細(xì)胞溶酶體活性繼而參與終末分化纖維細(xì)胞的脫核作用。本課題將設(shè)計一系列實驗驗證Hsf4參與調(diào)控纖維細(xì)胞溶酶體活性的分子機(jī)制。
　　目的：應(yīng)用小鼠

5、晶狀體上皮細(xì)胞系mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b研究Hsf4調(diào)控溶酶體活性的分子機(jī)制。
　　方法：⑴收集mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b細(xì)胞，用Western-blot檢測細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ的比例；應(yīng)用免疫熒光觀察LC3自噬活化顆粒的數(shù)量，揭示Hsf4對自噬通路的調(diào)控作用；⑵應(yīng)用表達(dá)GFP-LC3質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b細(xì)胞，用雷帕霉

6、素Rapamycin和氯喹Chloroquine分別處理細(xì)胞，Rapamycin激活細(xì)胞內(nèi)的自噬, Chloroquine則抑制溶酶體對自噬小體的降解，應(yīng)用Western-blot檢測GFP-LC3分子中GFP的降解速度，觀察Hsf4對溶酶體活性的檢測；⑶不同濃度Chloroquine處理轉(zhuǎn)染GFP-LC3的mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b，Western-blot觀察游離GFP的變化；⑷用Western-blot

7、、免疫熒光檢測溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP1、LAMP2（溶酶體標(biāo)記物）在mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b的表達(dá)和定位，測定Hsf4對溶酶體數(shù)量和活性的調(diào)控；⑸用Magic Red染色，免疫熒光檢測溶酶體內(nèi) Cathepsin B的活性，從而檢測mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b內(nèi)溶酶體Cathepsin B的活性是否受Hsf4b調(diào)控；⑹免疫共沉淀CO-IP檢測alphaB-crystallin是否

8、與ATP6VIA有相互作用，驗證Hsf4b是否通過其下游蛋白影響溶酶體活性。
　　結(jié)果：①過表達(dá)Hsf4b導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自噬反應(yīng)增強(qiáng)；②Rapamycin短時間處理，晶狀體上皮細(xì)胞自噬增強(qiáng)。處理時間延長后，mlec-HA-Hsf4b的LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ明顯降低，可能由于Hsf4b促進(jìn)溶酶體活性將更多的LC3-Ⅱ降解；③Hsf4b能增加 GFP-LC3分子中 GFP在溶酶體中的降解。晶狀體上皮細(xì)胞經(jīng)雷帕霉素（Rapamycin）處理

9、后，細(xì)胞內(nèi)溶酶體活性整體升高；④不同濃度氯喹（Chloroquine）處理兩種晶狀體上皮細(xì)胞，可明顯的增加 GFP-LC3在mlec-HA-Hsf4b細(xì)胞內(nèi)的堆積，說明Hsf4b能提高溶酶體對GFP分子的降解速度；⑤Magic Red染色發(fā)現(xiàn)Hsf4b能增加Cathepsin B的蛋白酶水解活性，直接說明Hsf4b增強(qiáng)溶酶體活性；⑥通過Western-blot檢測溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP1、LAMP2在晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Hsf4

10、b不影響溶酶體的數(shù)量，但通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)Hsf4b影響溶酶體的定位方式。LAMP1以聚積狀態(tài)分布于在mlec-Hsf4b-/-核周，而均勻分布于mlec-HA-Hsf4b核周；LAMP2在mlec-Hsf4b-/-核周均勻分布，而在mlec-HA-Hsf4b細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)都存在；⑦CO-IP檢測暫未發(fā)現(xiàn)Hsf4b下游基因cryαb與ATP6VIA有相互作用，仍需進(jìn)一步確定。
　　結(jié)論：⑴Hsf4促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生；⑵Hsf4參與上調(diào)