HSF4在晶狀體發(fā)育中的作用及其突變導(dǎo)致白內(nèi)障的機(jī)制研究.pdf

1、熱休克因子是生物體內(nèi)的一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)調(diào)控?zé)嵝菘说鞍讘?yīng)對(duì)內(nèi)外環(huán)境的各種脅迫,并參與機(jī)體的多種生理功能。熱休克因子4(Heat Shock Factor4,HSF4)在晶狀體細(xì)胞中高度表達(dá),在晶狀體的形成和分化過(guò)程中起重要的作用。HSF4突變可導(dǎo)致先天性和老年性白內(nèi)障的發(fā)生,但是HSF4導(dǎo)致白內(nèi)障的分子機(jī)理并不完全清楚。本論文從HSF4基因與DNA損傷修復(fù)、HSF4調(diào)控DNA酶DLAD,以及HSF4和p53的相互作用關(guān)系等三個(gè)全新

2、的方面,研究HSF4的功能及其突變引起白內(nèi)障的病理機(jī)制。
　　晶狀體中DNA損傷的不斷累積是老年性白內(nèi)障生成的一個(gè)重要原因,及時(shí)地清除DNA損傷對(duì)維持晶狀體的正常功能十分必要。在本研究中,我們首先發(fā)現(xiàn)HSF4能夠促進(jìn)修復(fù)紫外線(xiàn)導(dǎo)致的DNA損傷和DNA鏈的斷裂,而HSF4的白內(nèi)障致病突變不具有修復(fù)這些DNA損傷的能力。Rad51是DNA同源重組修復(fù)通路中的關(guān)鍵催化酶。我們的研究發(fā)現(xiàn)HSF4通過(guò)調(diào)控Rad51起到DNA損傷修復(fù)功能:利

3、用Rad51啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告載體和染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)HSF4能直接結(jié)合在Rad51啟動(dòng)子上的熱休克元件上啟動(dòng)其轉(zhuǎn)錄表達(dá),而HSF4的白內(nèi)障致病突變卻失去此功能;通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡技術(shù),進(jìn)一步證實(shí)HSF4的DNA損傷修復(fù)功能是依賴(lài)于Rad51;過(guò)表達(dá)Rad51可以回補(bǔ)由HSF4突變導(dǎo)致的DNA損傷修復(fù)障礙;喜樹(shù)堿處理能夠通過(guò)抑制Rad51表達(dá)水平的上調(diào)進(jìn)而抑制HSF4的DNA損傷修復(fù)功能;在斑馬魚(yú)中利用morpho

4、lino技術(shù)敲除HSF4,導(dǎo)致斑馬魚(yú)中Rad51的表達(dá)減少,及晶狀體中DNA損傷增加。我們的研究首次明確表明先天性白內(nèi)障的致病基因能夠直接參與DNA損傷修復(fù),為了解先天性和老年性白內(nèi)障形成的病理機(jī)制提供了一個(gè)全新的視角。
　　晶狀體纖維細(xì)胞的去核過(guò)程是完成晶狀體分化的必要步驟。DNase2β(DLAD)是脊椎動(dòng)物晶狀體中存在的主要Dnase,在晶狀體分化過(guò)程中發(fā)揮重要功能,敲除DLAD的小鼠會(huì)出現(xiàn)核性白內(nèi)障表型。通過(guò)DLAD啟動(dòng)子

5、熒光素酶報(bào)告載體和染色質(zhì)沉淀實(shí)驗(yàn),我們的研究發(fā)現(xiàn)HSF4通過(guò)直接結(jié)合在DLAD的啟動(dòng)子上上調(diào)DLAD的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)其Dnase活性。HSF4的白內(nèi)障致病突變破壞其與DLAD啟動(dòng)子的結(jié)合能力,喪失其上調(diào)DLAD表達(dá)的能力從而影響Dnase活性。在體內(nèi),我們應(yīng)用morpholino抑制斑馬魚(yú)HSF4表達(dá),發(fā)現(xiàn)HSF4下調(diào)的斑馬魚(yú),晶狀體在分化過(guò)程中細(xì)胞核的去除不完全。與之相一致的是斑馬魚(yú)DLAD的蛋白水平和Dnase活性下降。說(shuō)明H

6、SF4通過(guò)上調(diào)DLAD的表達(dá),參與晶狀體分化的去核化過(guò)程。我們的研究結(jié)果找到了一條解釋HSF4突變導(dǎo)致白內(nèi)障生成的全新分子途徑,幫助我們更深入地了解HSF4在晶狀體分化中的功能。
　　應(yīng)用免疫共沉淀和pulldown技術(shù),我們首次發(fā)現(xiàn)HSF4和p53存在相互作用。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為我們研究HSF4和p53在晶狀體分化和發(fā)育中的功能,揭示相關(guān)的調(diào)控通路,為我們進(jìn)一步研究HSF4和p53在白內(nèi)障生成中的分子機(jī)制提供了全新的思路。
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