利用U2-OS細(xì)胞表達(dá)rhBMP-7的研究.pdf

1、人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（Human bone morphogenetic protein-7，hBMP-7），又名成骨蛋白-1（Osteogenic Protein，OP-1），屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)超家族。hBMP-7能夠誘導(dǎo)動(dòng)物或人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱和神經(jīng)組織，在臨床骨科領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景，可用于促進(jìn)脊柱融合和治療骨折、骨缺損、骨不連、股骨

2、頭缺血性壞死等。但是，在基因工程表達(dá)該蛋白的過程中遇到了一些難以克服的難題。原核表達(dá)系統(tǒng)由于缺乏翻譯后加工、修飾機(jī)制，使表達(dá)的蛋白復(fù)性困難;畢赤酵母的糖基化形式與人類存在差異亦不利于該蛋白的表達(dá);CHO細(xì)胞表達(dá)的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（rhBMP-7）雖有活性，但是表達(dá)量很低，尚不具備產(chǎn)業(yè)化條件，因此，國內(nèi)外生產(chǎn)此蛋白的公司極少，價(jià)格昂貴。所以，能否克服如上困難是rhBMP-7能否真正實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。
　　目的：人源癌細(xì)胞具有

3、完整的翻譯后加工機(jī)制、可無限增殖和體外易培養(yǎng)的特點(diǎn)，能否讓其“棄惡從善”用于表達(dá)具有臨床應(yīng)用價(jià)值、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的課題。本研究擬利用人源癌細(xì)胞U2-OS進(jìn)行rhBMP-7蛋白的表達(dá)，以探討人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)rhBMP-7的可行性，本研究有可能為復(fù)雜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的高效表達(dá)提供一種新的解決方案。
　　方法：⑴rhBMP-7在U2-OS細(xì)胞中的表達(dá):構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-rhBMP-7，利

4、用Lipofectamine2000將真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至U2-OS細(xì)胞中，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)rhBMP-7基因在mRNA水平上的表達(dá);Western Blot法檢測(cè)rhBMP-7的表達(dá)。⑵分泌性rhBMP-7的表達(dá):分析三種信號(hào)肽（hBMP-7自身信號(hào)肽B7、人基質(zhì)金屬蛋白酶-9信號(hào)肽M9、人纖溶酶原信號(hào)肽SP）對(duì)U2-OS細(xì)胞分泌表達(dá)rhBMP-7的影響。構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-rhB7-hBMP7、pcDNA3.

5、1-rhSP-hBMP7、pcDNA3.1-rhM9-hBMP7。利用Lipofectamine2000將真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至U2-OS細(xì)胞中，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)rhBMP-7基因在mRNA水平上的表達(dá)，Western Blot法檢測(cè)U2-OS細(xì)胞內(nèi)與其培養(yǎng)基中分泌表達(dá)的rhBMP-7。在Western Blot檢測(cè)分泌表達(dá)的rhBMP-7的基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用ELISA檢測(cè)U2-OS細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外分泌表達(dá)的rhBMP-7。⑶rhB

6、MP-7的純化與分析:選用親和層析法純化細(xì)胞分泌表達(dá)的rhBMP-7蛋白;通過糖苷內(nèi)切酶酶切樣品rhBMP-7，對(duì)其進(jìn)行糖基化分析;純化的rhBMP-7作用于NIH3T3細(xì)胞，通過檢測(cè)NIH3T3細(xì)胞的ALP活性，分析rhBMP-7的生物活性。
　　結(jié)果：①Western Blot結(jié)果顯示rhBMP-7蛋白分子量為65-75KDa，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中rhBMP-7表達(dá)量高于陰性對(duì)照組。結(jié)果表明rhBMP-7可在U2-OS細(xì)胞中表達(dá)。②研

7、究分泌性rhBMP-7的表達(dá)中，通過Western Blot與ELISA檢測(cè)U2-OS細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外分泌表達(dá)的rhBMP-7，結(jié)果表明U2-OS細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外均有表達(dá)rhBMP-7。ELISA結(jié)果顯示細(xì)胞外表達(dá)的rhBMP-7蛋白量高于細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的rhBMP-7，說明rhBMP-7實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，而且hBMP-7自身信號(hào)肽引導(dǎo)的U2-OS細(xì)胞分泌表達(dá)的rhBMP-7蛋白量較高。③經(jīng)鎳柱純化得到rhBMP-7蛋白，通過BCA法測(cè)得rhBM

8、P-7蛋白濃度為28.3mg/L，在緩沖液中可完全溶解。rhBMP-7經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示條帶單一，純度較好。④通過糖苷內(nèi)切酶(Endo H)酶切rhBMP-7對(duì)其進(jìn)行糖基化分析。未經(jīng)Endo H酶切的rhBMP-7單體rhBMP-7蛋白分子量為34-40KDa，二聚體rhBMP-7蛋白分子量為65-75KDa。經(jīng)Endo H酶切的rhBMP-7單體蛋白分子量為17-20KDa，二聚體rhBMP-7蛋白分子量為34-40KDa。根

9、據(jù)Endo H酶切rhBMP-7的結(jié)果得出:U2-OS細(xì)胞對(duì)表達(dá)rhBMP-7蛋白進(jìn)行了糖基化修飾。⑤rhBMP-7對(duì)NIH3T3細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)的影響結(jié)果顯示:含rhBMP-7培養(yǎng)基使NIH3T3細(xì)胞的ALP活性明顯增強(qiáng)，而且呈現(xiàn)出明顯的量、效關(guān)系，表明U2-OS細(xì)胞表達(dá)的rhBMP-7具有生物活性。
　　結(jié)論：⑴驗(yàn)結(jié)果表明，可以利用U2-OS細(xì)胞表達(dá)rhBMP-7，而且信號(hào)肽會(huì)影響細(xì)胞對(duì)表達(dá)蛋白的分泌效率;hBMP-7