PP-rhBMP-4m的表達(dá)、純化和活性.pdf

1、用基因工程手段制備蛋白質(zhì)最常用的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，它有融合表達(dá)和非融合表達(dá)兩種形式。將編碼目的蛋白的基因與表達(dá)載體上能夠高表達(dá)已知蛋白質(zhì)或多肽的基因融合，是融合表達(dá)形式。這種表達(dá)形式有很多優(yōu)點(diǎn)： 首先是容易做到目的蛋白的高表達(dá)；其次融合的蛋白質(zhì)或多肽的親水性或分子伴侶性質(zhì)能使表達(dá)的融合蛋白易于溶解或復(fù)性；融合表達(dá)可以帶有各種標(biāo)簽，便于純化和鑒定等。因而融合表達(dá)成為研究蛋白質(zhì)功能、研制基因工程蛋白質(zhì)藥物的常用手段。各生物技術(shù)公司

2、構(gòu)建的多種商售蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體也已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。但目前所用的融合表達(dá)載體有共同的缺點(diǎn)：帶在目的蛋白上的標(biāo)簽蛋白不易被去除，融合的標(biāo)簽蛋白會(huì)在體內(nèi)引起不必要的免疫反應(yīng)或影響目的蛋白的活性和正常行徑等。常用的酶學(xué)方法來(lái)切除標(biāo)簽，不僅費(fèi)用昂貴，且效率不高，目的蛋白的回收率低。已知的化學(xué)裂解方法，如溴化氰法等，因其劇毒等原因又很少使用。 骨形成蛋白4（BMP-4）是骨形成蛋白家族的一員，人骨形成蛋白4 成熟肽（hBMP-4m）由l16

3、 個(gè)氨基酸組成。BMP-4 具有多種生理功能，除了誘導(dǎo)骨組織的形成外，對(duì)造血組織的形成具有重要的誘導(dǎo)分化作用，對(duì)三系血細(xì)胞都有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，這種作用較其它BMP 持久，是一種長(zhǎng)時(shí)間促進(jìn)血細(xì)胞生長(zhǎng)的因子。制備BMP-4 也面臨一個(gè)選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)的問(wèn)題。 用真核細(xì)胞表達(dá)，可以直接獲得有活性的BMP-4，但其產(chǎn)量低，價(jià)格昂貴，只適用于實(shí)驗(yàn)室研究，難以大規(guī)模生產(chǎn)，制約了其臨床應(yīng)用。使用大腸桿菌系統(tǒng)其表達(dá)蛋白量大，生產(chǎn)純化工藝較簡(jiǎn)單

4、，不失為一種選擇。本室曾克隆得hBMP-4m 的cDNA 編碼序列，克隆入pDH2 載體，在大腸桿菌中進(jìn)行非融合表達(dá)并純化制備（已獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利），但純化步驟復(fù)雜，蛋白損失量大，收得率低。 本文用hBMP-4m 作為靶基因，構(gòu)建了一種大腸桿菌甲酸水解融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)。用此系統(tǒng)不僅能高效表達(dá)目的蛋白、還能減少表達(dá)產(chǎn)物的純化步驟，并且獲得的蛋白具有與非融合表達(dá)的hBMP-4m 相似的生物學(xué)功能。該系統(tǒng)也可用于其他蛋白的表達(dá)。

5、 一、原核甲酸水解融合表達(dá)載體的構(gòu)建 目的：構(gòu)建能高效表達(dá)目的蛋白的甲酸水解融合表達(dá)載體。 方法：用PCR方法分別在hBMP-4m 基因的5’端加上編碼Asp-Pro-Pro 酸水解肽的不同簡(jiǎn)并碼序列，克隆入原核融合表達(dá)載體pRSET-B 中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS－PAGE 分析，觀(guān)察融合蛋白的表達(dá)效果。 結(jié)果：成功構(gòu)建9個(gè)不同簡(jiǎn)并碼序列的酸水解肽融合表達(dá)載體，分別命名為pRSET-DP

6、P-rhBMP4m 1~9；經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)分析，只有在兩個(gè)脯氨酸的密碼子均為CCG 時(shí)，融合蛋白才能高效表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到細(xì)菌總蛋白量的38.4％。 結(jié)論：改變表達(dá)肽鏈中段氨基酸密碼子的堿基序列可以顯著影響融合蛋白的表達(dá)效果。 二、甲酸水解融合表達(dá)載體的應(yīng)用 目的：利用已構(gòu)建好的甲酸水解融合表達(dá)載體系統(tǒng)大量表達(dá)并純化PP-rhBMP-4m。 方法：用可高效表達(dá)的pRSET-DPP-rhBMP-4m 系統(tǒng)進(jìn)行大規(guī)

7、模發(fā)酵，包涵體洗滌后，溶解于8M 尿素變性液；利用鎳離子親和層析柱直接純化融合蛋白，用甲酸裂解去除6×His-D 標(biāo)簽肽段；SDS-PAGE 分析目的蛋白，并進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，計(jì)算目的蛋白得率。 結(jié)果：經(jīng)發(fā)酵、裂菌、洗滌等操作，融合蛋白純度達(dá)到57％以上；經(jīng)鎳離子親和層析柱純化后，目的蛋白純度為98％；目的蛋白得率為69.8％；甲酸裂解效率達(dá)到93％以上。 結(jié)論：我們構(gòu)建的pRSET-DPP-rhBMP-4m 是一種可以

8、有效去除融合標(biāo)簽，純化目的蛋白的融合表達(dá)系統(tǒng)。 三、PP-rhBMP-4m 細(xì)胞活性檢測(cè) 目的：檢測(cè)氨基端帶有兩個(gè)脯氨酸的目的蛋白PP-rhBMP-4m 與非融合表達(dá)的目的蛋白rhBMP-4m 的生物學(xué)活性是否相當(dāng)。 方法：分別用PP-rhBMP-4m 和rhBMP-4m 刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞和帶有熒光素酶報(bào)告基因的C2C12K5 及NIH3T3K2 細(xì)胞（國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利號(hào)：ZL 01 1 31813.9）；MTT 法

9、檢測(cè)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖情況；檢測(cè)用藥前后骨髓基質(zhì)細(xì)胞ALP 表達(dá)量的變化；檢測(cè)用藥前后C2C12K5 及NIH3T3K2 細(xì)胞熒光素酶活性的變化。 結(jié)果：兩種蛋白均可促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖，并且ALP 值均有增高，兩組間無(wú)顯著性差異（p>0.05）；熒光素酶活性分析顯示，不管是C2C12K5 還是NIH3T3K2都在被PP-rhBM-4m或rhBMP-4m刺激后熒光素酶活性有所增強(qiáng)，兩種刺激因子無(wú)顯著性差異（p>0.05）。

10、 結(jié)論：PP-rhBMP-4m、rhBMP-4m 在細(xì)胞活性方面沒(méi)有差異。我們?cè)谠O(shè)計(jì)大腸桿菌融合表達(dá)載體時(shí)，利用甲酸水解位點(diǎn)（Asp-Pro）的同時(shí)，也利用了哺乳動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的脯氨酰肽酶（Prolyl peptidases）能夠切除肽鏈氨基端第二個(gè)氨基酸殘基為Pro 的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了Asp-Pro-Pro三肽序列。用它連接標(biāo)簽蛋白和目的蛋白，即形成“標(biāo)簽蛋白－Asp-Pro-Pro－目的蛋白”的結(jié)構(gòu)。在得到這樣的肽鏈之后，首先可以利

11、用甲酸水解去除標(biāo)簽蛋白，然后將氨基端帶有兩個(gè)脯氨酸（Pro-Pro）的目的蛋白放入動(dòng)物體內(nèi)，利用哺乳動(dòng)物體內(nèi)的脯氨酰肽酶將兩個(gè)脯氨酸去除，最終使目的蛋白在體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。另外，我們構(gòu)建的這種甲酸水解融合表達(dá)載體可用于多種蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化，尤其適合于小分子肽的表達(dá)。因?yàn)槿诤系鞍啄茉黾颖磉_(dá)小分子肽的穩(wěn)定性；Asp-Pro-Pro 這個(gè)結(jié)構(gòu)又可以用于小分子肽之間的連接，構(gòu)建小分子肽串聯(lián)體，這樣既可以克服小分子肽不易表達(dá)，不易檢測(cè)等缺點(diǎn)，