高濃度rhBMP-2m復(fù)性條件的探討.pdf

1、目的：
　　骨形成蛋白2（bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2）是骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein,BMP）家族的一員。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)15種以上不同的人BMP。其中以人BMP－2誘骨活性最強(qiáng)，并與其他BMP有協(xié)同作用。BMP2的活性形式是二聚體，在BMP成熟肽單鏈中有七個(gè)半胱氨酸殘基，形成三個(gè)肽鏈內(nèi)二硫鍵，兩條肽鏈間再通過(guò)一個(gè)二硫鍵連接后才具有活性。
　　大腸桿菌是最常

2、用的基因工程表達(dá)系統(tǒng)。雖然它不能象真核系統(tǒng)一樣進(jìn)行翻譯后加工，但由于其遺傳背景清楚、使用安全、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高、生產(chǎn)周期短和成本低的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在仍是使用最廣泛，不可替代的表達(dá)系統(tǒng)。用真核表達(dá)的rhBMP-2m雖然活性很好，但是其生產(chǎn)成本太高，產(chǎn)品昂貴，難于大規(guī)模生產(chǎn)，限制了其臨床的應(yīng)用。我們采用大腸桿菌系統(tǒng)非融合表達(dá)目的蛋白rhBMP-2m，其表達(dá)產(chǎn)量高，但是由于大腸桿菌本身的特性使其表達(dá)產(chǎn)物以無(wú)活性的包含體形式存在。這就需要進(jìn)一步的復(fù)性

3、才能得到有活性的目的蛋白。由于成熟的活性二聚體BMP是有7個(gè)二硫鍵、疏水性強(qiáng)的分子，其復(fù)性難度大，至今還沒(méi)有理想的方法。本文就是在高密度發(fā)酵，純化rhBMP-2m的基礎(chǔ)上進(jìn)行rhBMP-2m的復(fù)性方法的探討，找出適合rhBMP-2m復(fù)性的方法，然后進(jìn)行細(xì)胞的測(cè)活，檢驗(yàn)復(fù)性效果。
　　方法：
　　1.rhBMP-2m的高密度發(fā)酵：用15LNBS發(fā)酵罐，采用恒溶氧－補(bǔ)料分批培養(yǎng)的方法進(jìn)行DH5α/pDH2-BMP-2m的高密度發(fā)

4、酵。在發(fā)酵過(guò)程中始終保持溶氧40％，pH7.0。32℃生長(zhǎng)6h后，恒速添加補(bǔ)料。16h后將溫度在最短時(shí)間內(nèi)升高到42℃誘導(dǎo)表達(dá)4h，結(jié)束發(fā)酵。
　　2.rhBMP-2m的純化：高密度發(fā)酵后的菌液，用STE、溶菌酶、脫氧膽酸鈉和超聲裂菌后，用TrionX-100進(jìn)行4次包含體的超聲處理和洗滌。經(jīng)洗滌的包含體進(jìn)行SP-SepharoseFF陽(yáng)離子柱層析和Q-SepharoseFF陰離子柱層析兩次純化。
　　3.rhBMP-2m的

5、復(fù)性：按朱幫福建立的BMP活性檢測(cè)方法（國(guó)家專(zhuān)利ZL01131813.9），經(jīng)純化后的目的蛋白rhBMP-2m在不同的溫度、復(fù)性液pH、氧化交換系統(tǒng)濃度、鹽濃度等條件下進(jìn)行透析復(fù)性。透析復(fù)性后進(jìn)行非還原的SDS-PAGE,檢測(cè)rhBMP-2m活性形式二聚體的含量，同時(shí)找出相對(duì)較優(yōu)的復(fù)性方法并對(duì)其復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行0.22μm微孔濾膜除菌并計(jì)算其損失率。
　　4.復(fù)性后rhBMP-2m活性鑒定：將復(fù)蘇后的C2C12細(xì)胞培養(yǎng)48h后按1×1

6、05個(gè)細(xì)胞接種于24孔板上，將每個(gè)樣品分3個(gè)濃度梯度(0.2mg/mL，0.02mg/mL，0.002mg/mL)加入。另每個(gè)樣品設(shè)立2個(gè)對(duì)照孔。1個(gè)為空白對(duì)照，只加入培養(yǎng)液；1個(gè)為復(fù)性前樣品(濃度為1mg/ml)。在二氧化碳溫箱中37℃培養(yǎng)24h后檢測(cè)其熒光值，對(duì)比復(fù)性前后rhBMP-2m的活性變化。
　　結(jié)果與討論：
　　1.rhBMP-2m的高密度發(fā)酵：經(jīng)高密度發(fā)酵后，發(fā)酵液的OD600值為60.5，4L發(fā)酵液離心收集

7、的菌體濕重為386g。SDS-PAGE后經(jīng)灰度掃描，目的蛋白占菌體總蛋白的20％。發(fā)酵過(guò)程中菌種接種濃度、接種時(shí)的無(wú)菌環(huán)境、培養(yǎng)基的成分、補(bǔ)料的成分、流加的方式及流加速度、pH、溶氧和溫度等因素對(duì)高密度發(fā)酵的結(jié)果均有影響，在發(fā)酵過(guò)程中要控制發(fā)酵的每個(gè)環(huán)節(jié)并優(yōu)化每個(gè)影響因素才能得到理想的結(jié)果。而且試管搖菌誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)目的蛋白占總蛋白質(zhì)的比例一般都高于高密度發(fā)酵的誘導(dǎo)表達(dá)，表明我們的高密度發(fā)酵和表達(dá)的條件還沒(méi)有很好地優(yōu)化。
　　2.rh

8、BMP-2m的純化：高密度發(fā)酵后目的蛋白純度為20％，經(jīng)四次包含體洗滌后的純度達(dá)到75％，回收率為51.19％。洗滌后的包含體經(jīng)陽(yáng)離子柱層析純化后純度達(dá)到85％，總回收率為32.23％。再次經(jīng)陰離子柱層析后純度達(dá)到95％，總回收率為19.70％。從洗滌和純化數(shù)據(jù)中我們可以看出，包含體洗滌和純化的次數(shù)越多，蛋白純度越高但其損失也越大。所以純化時(shí)要綜合考慮蛋白的性質(zhì)、所需蛋白的純度、蛋白回收率和純化的成本以選擇適合的純化方法。
　　3

9、.rhBMP-2m的復(fù)性：本實(shí)驗(yàn)探討了不同因素對(duì)rhBMP-2m復(fù)性的影響，包括pH、溫度、蛋白的濃度等。我們發(fā)現(xiàn)復(fù)性的pH、溫度對(duì)蛋白復(fù)性的結(jié)果影響很大，但鹽濃度、氧化交換系統(tǒng)的濃度和透析外液體積對(duì)蛋白復(fù)性影響不是很大。pH8.5時(shí)復(fù)性效率較高，二聚體的含量達(dá)到了30％；而pH4.8時(shí)rhBMP-2m完全可溶。低溫4℃有利于復(fù)性蛋白的正確折疊，其二聚體含量達(dá)到30％。在高的蛋白濃度10mg/ml時(shí)復(fù)性效率可以和0.1mg/ml蛋白濃度

10、的復(fù)性效率相當(dāng)，而高濃度有利于復(fù)性后蛋白的濃縮回收，減少?gòu)?fù)性rhBMP的損失，降低工作強(qiáng)度，節(jié)省工作時(shí)間，從而有利于工業(yè)放大。在透析除尿素的過(guò)程中我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，透析復(fù)性時(shí)rhBMP-2m的濃度最大只能達(dá)到6mg/ml，超過(guò)這一濃度即使改變pH，在除去變性劑尿素時(shí)目的蛋白都會(huì)沉淀析出。考慮到復(fù)性時(shí)rhBMP-2m的可溶性及后續(xù)的濃縮回收，我們采用6mg/ml高蛋白濃度的改變pH的方法進(jìn)行透析復(fù)性，實(shí)現(xiàn)了高pH（pH8.5）條件下復(fù)性后，

11、在低pH（pH4.8）條件下用一步透析和分步透析除變性劑尿素。用合適的蛋白濃度及改變pH的透析復(fù)性較好的解決了rhBMP-2m的可溶性問(wèn)題，使得過(guò)濾除菌成為可能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)經(jīng)該方法復(fù)性后微孔濾膜除菌蛋白損失很小不超過(guò)10％。經(jīng)一步透析和分步透析除尿素的方法對(duì)復(fù)性后rhBMP-2m的活性形式二聚體的含量沒(méi)有影響。這復(fù)性方案解決了以往稀釋法等低蛋白濃度復(fù)性后濃縮時(shí)rhBMP嚴(yán)重?fù)p失和應(yīng)用時(shí)難以除菌的難題。
　　4.復(fù)性后rhBMP

12、-2m的活性鑒定：同時(shí)細(xì)胞測(cè)活顯示兩組活性均較復(fù)性前的蛋白有明顯的升高復(fù)性前rhBMP-2m熒光值為5左右，復(fù)性后20μg/mL的rhBMP-2m經(jīng)一步透析除尿素和分步透析除尿素的熒光值達(dá)到最大均為20左右。經(jīng)T檢驗(yàn)（p<0.001）可以看出復(fù)性前后rhBMP-2m的活性有顯著差別，但是一步與分步除尿素兩者之間的細(xì)胞活性并沒(méi)有明顯的差別(p>0.005)。
　　雖然理論上推測(cè)一步透析除尿素使得rhBMP-2m的環(huán)境改變劇烈會(huì)引起二