Thanatin的原核表達(dá)、純化及其抗菌活性的檢測.pdf

1、Thanatin最初是從半翅目昆蟲刺肩蝽(Podisus maculiventris)的血淋巴中分離的,它與蛙brevinins、蜂毒素和鱟肽素等抗菌肽相似也是通過誘導(dǎo)產(chǎn)生的。Thanatin是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)在生理濃度下對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及絲狀真菌有廣譜抗菌活性的昆蟲抗菌肽,它對于臨床多重耐藥菌如產(chǎn)氣腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌也具有抗菌活性。此外,Thanatin轉(zhuǎn)基因水稻具有抵抗稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的能

2、力,推測是由于 Thanatin在感染的最初階段抑制了稻瘟病菌的活性。Thanatin由21個(gè)氨基酸組成(GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM),它的中心是一個(gè)β折疊結(jié)構(gòu),由二硫鍵維持。從第8位氨基酸殘基(I8)到C末端形成反向平行的β折疊,兩個(gè)半胱氨酸殘基(Cys11,Cys18)形成一個(gè)二硫鍵,C末端帶強(qiáng)陽離了,這些結(jié)構(gòu)與蛙皮膚分泌的抗菌肽brevinins家族相似。結(jié)構(gòu)活性關(guān)系研究指出4個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)hanatin的生物活性是

3、重要的:(1)C末端袢；(2)C末端3個(gè)氨基酸殘基；(3)N末端伸展的7個(gè)疏水性氨基酸殘基；(4)N末端3個(gè)氨基酸殘基。其中C末端3個(gè)氨基酸對革蘭氏陰性菌和一些革蘭氏陽性菌的抗菌活性起關(guān)鍵作用。N末端3個(gè)氨基酸對穩(wěn)定反向平行的β折疊結(jié)構(gòu)很重要,而且對抗真菌活性是必需的。為了研究結(jié)構(gòu)-效應(yīng)關(guān)系,將Thanatin基因序列隨機(jī)突變,結(jié)果表明維持反向平行的β折疊形成C末端袢的氫鍵結(jié)構(gòu)對于大腸桿菌的抗菌活性是至關(guān)重要的。改造Thanatin的結(jié)

4、構(gòu),在半胱氨酸側(cè)鏈上用基團(tuán)CH3、C2H5、C8H17修飾,研究Thanatin抗菌活性的改變。經(jīng)C8H17基團(tuán)修飾后,Thanatin對藤黃微球菌的抗菌作用優(yōu)于野生型,提示半胱氨酸側(cè)鏈的疏水性與抗菌活性之間有平行關(guān)系。將Thanatin中形成分子間二硫鍵的兩個(gè)半胱氨酸殘基間的叔丁?；鶊F(tuán)改造成C11tBu/C18tBu,對革蘭氏陽性菌如藤黃微球菌的抗菌作用增強(qiáng)但是對于革蘭氏陰性菌如大腸桿菌的抗菌作用則下降。這些結(jié)果表明二硫鍵的形成不僅對

5、Thanatin的抗菌活性是必不可少的,而且對于不同細(xì)菌抗菌作用的特異性也密切相關(guān)。Thanatin對大腸桿菌的抑制作用與C末端的β折疊結(jié)構(gòu)有關(guān),而對藤黃微球菌卻與β折疊結(jié)構(gòu)沒有直接關(guān)系而是與側(cè)鏈的疏水性密切相關(guān)。
　　 抗菌肽天然來源有限,提取和純化比較困難,限制了抗菌肽在醫(yī)藥、食品、畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)等方面的廣泛應(yīng)用。利用基因工程的方法在細(xì)菌中表達(dá)抗菌肽是目前最為簡單和廉價(jià)的方式。但是抗菌肽直接在大腸桿菌中表達(dá)需要面臨很多問題,如

6、抗菌肽對宿主細(xì)胞的毒性、小分子肽容易被蛋白酶降解。因此抗菌肽通常以融合蛋白的形式表達(dá)以提高穩(wěn)定性。然而將抗菌肽從融合蛋白中切割分離出來將會面臨很多困難。重組融合蛋白通常用溴化氰、羥胺、腸激酶等切割,這些方法會在抗菌肽的末端殘留不需要的氨基酸殘基,影響抗菌肽的氨基酸組成和空間結(jié)構(gòu),導(dǎo)致抗菌肽的生物活性下降或完全喪失。而且,抗菌肽的氨基酸組成大都在12～50個(gè)左右,分子量也在4KD左右,融合表達(dá)后蛋白酶的去除純化步驟復(fù)雜。
　　 由

7、于Thanatin結(jié)構(gòu)簡單,通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后不改變Thanatin的一級結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象。為了研究在大腸桿菌ER2566中表達(dá)的抗菌肽Thanatin的抗菌活性,我們將Thanatin基因與內(nèi)含肽(Intein)融合表達(dá),通過DTT誘導(dǎo)內(nèi)含肽的高效自身剪切,可獲得純化的單體Thanatin目的蛋白。實(shí)驗(yàn)中我們將Thanatin基因與內(nèi)含肽的C末端連接,構(gòu)建原核表達(dá)載體pTYB11-Thanatin,轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566,通過

8、IPTG誘導(dǎo)使Thanatin與內(nèi)含肽融合表達(dá)。內(nèi)含肽能與幾丁質(zhì)特異性的結(jié)合,通過親和層析,融合蛋白結(jié)合在幾丁質(zhì)樹脂上。在DTT和半胱氨酸的作用下可誘導(dǎo)內(nèi)含肽的自身剪切,目的蛋白從融合蛋白中切割分離出來,經(jīng)洗脫可以得到可溶性的目的蛋白而且沒有源自載體的額外氨基酸殘留,充分保證抗菌肽Thanatin完整的結(jié)構(gòu)和生物活性。整個(gè)純化過程中沒有使用蛋白酶,步驟簡單易行。
　　 大腸桿菌是腸道中大量存在的一種正常菌群。隨著三代頭孢菌素等抗

9、生素的廣泛使用,大腸桿菌已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原體。由于產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases,ESBLs)大腸桿菌的存在,引起對抗生素嚴(yán)重的耐藥性,導(dǎo)致病人治療難度增加、治療費(fèi)用加大,甚至引起死亡。ESBLs是一種質(zhì)粒誘導(dǎo)的水解酶類,它可以水解一代和二代的頭孢菌素、青霉素、廣譜頭孢菌素和酰胺類抗生素,克拉維酸鹽和舒巴坦可以抑制它的活性。ESBLs的存在是臨床上β內(nèi)酰胺類抗生素對于革蘭氏陰性菌

10、產(chǎn)生耐藥性的最重要的因素。攜帶ESBLs的質(zhì)粒通常含有其它的耐藥基因如氨基糖苷類抗生素抑制基因,導(dǎo)致產(chǎn)生多重耐藥的革蘭氏陰性菌,尤其多見于大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌。在抗生素的選擇性壓力下,含有ESBLs的細(xì)菌能夠產(chǎn)生新的耐藥機(jī)制,并且通過質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)可以在不同的菌株間快速傳播,可導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)感染的大爆發(fā)。因此,應(yīng)用不同的殺菌機(jī)制生產(chǎn)新的抗生素或替代物有深遠(yuǎn)的意義。作為一種抗菌肽,Thanatin是通過抑制細(xì)胞呼吸來發(fā)揮抗菌作用的,并對

11、產(chǎn)ESBLs細(xì)菌的抑制方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢,將來有望發(fā)展成為抗生素的替代物。
　　 目的:
　　 1.Thanatin在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)和純化；
　　 2.大腸桿菌表達(dá)的重組Thanatin抗菌活性的檢測；
　　 3.對原核表達(dá)純化的Thanatin應(yīng)用前景的評價(jià)。
　　 方法:
　　 1.將Thanatin基因序列的原始密碼子改造為大腸桿菌偏愛密碼子,設(shè)計(jì)一對相互重疊的引物,采用SOE

12、法人工合成Thanatin基因并擴(kuò)增Thanatin基因片段；
　　 2.利用連接反應(yīng)構(gòu)建pMD 18-T-Thanatin重組質(zhì)粒,并進(jìn)行測序分析；
　　 3.將Thanatin基因與內(nèi)含肽的C末端連接,利用酶切、連接反應(yīng)構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒PTYB11-Thanatin并對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定:
　　 4.將重組質(zhì)粒PTYB11-Thanatin轉(zhuǎn)入大腸桿菌ER2566中,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；
　　 5.

13、優(yōu)化pTYB11-Thanatin/ER2566的表達(dá)條件；
　　 6.應(yīng)用幾丁質(zhì)吸附柱親和層析法純化目的蛋白Thanatin；
　　 7.將純化后得到的Thanatin采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂孔穴擴(kuò)散法,以耐藥綠膿假單胞菌、耐藥產(chǎn)毒大腸桿菌、0-157大腸埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、福氏志賀菌、宋內(nèi)志賀菌、嗜麥芽黃單胞菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌以及110株大腸桿菌臨床標(biāo)本為試驗(yàn)菌株,測量抑菌圈直徑；
　　 8.

14、比較80株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌和30株敏感大腸桿菌的抑菌圈直徑大小的差異,使用SPSS 13.0軟件應(yīng)用兩樣本,檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；
　　 結(jié)果:
　　 1.克降了Thanatin基因并成功構(gòu)建PTYB11-Thanatin原核表達(dá)載體；
　　 2.在大腸桿菌ER2566中融合表達(dá)Thanatin重組蛋白,重組蛋白主要以可溶形式表達(dá)；
　　 3.通過幾丁質(zhì)吸附柱親和層析得到純化的目的蛋白Thanatin；

15、
　　 4.純化后的Thanatin對臨床革蘭氏陰性菌有明顯的抑制作用,對于臨床耐藥菌如耐藥綠膿假單胞菌、耐藥產(chǎn)毒大腸桿菌、O-157大腸埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、福氏志賀菌、宋內(nèi)志賀菌、嗜麥芽黃單胞菌和真菌如白色念珠菌以及產(chǎn)ESBLs大腸桿菌有明顯的抑菌活性。但是Thanatin對革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌沒有抑菌活性。
　　 5.純化后的Thanatin對110株大腸桿菌臨床標(biāo)木進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn),數(shù)據(jù)結(jié)果

16、經(jīng)SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,采用兩樣本t檢驗(yàn)方法,結(jié)果表明Thanatin對于80株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌和30株敏感的大腸桿菌的抑菌作用沒有顯著性差異(P>0.05),產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑菌圈直徑為0.754±0.190cm,敏感的大腸桿菌的抑菌圈直徑為0.750±0.173cm。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過Thanatin基因與內(nèi)含肽的C末端連接構(gòu)建的PTYB11-Thanatin質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli