O-糖基轉(zhuǎn)移酶新亞家族的功能性質(zhì)研究及酶底物篩選法的建立.pdf

1、糖基化是細(xì)胞內(nèi)重要的翻譯后修飾過(guò)程，細(xì)胞內(nèi)有超過(guò)50％的蛋白質(zhì)可被糖基化。在許多生命過(guò)程中，糖鏈發(fā)揮了復(fù)雜的功能，如調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊與穩(wěn)定、淋巴歸巢、細(xì)胞黏連與遷移、宿主-病原體相互作用、免疫應(yīng)答、生物體繁殖和胚胎形成等。
　　糖基化分為N-糖基化和O-糖基化兩種，多肽:N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAc-T, EC2.4.1.41)是催化粘蛋白型O-糖基化修飾起始的糖基轉(zhuǎn)移酶。ppGalNAc-T是一個(gè)酶家族，每個(gè)成員都

2、有不同的組織表達(dá)分布和底物特異性。本文研究了該酶家族的一個(gè)新亞家族—Y亞家族基因的生化特性及功能。Y亞家族由ppGalNAc-T8、-T9、-T17和-T18組成，與其它ppGalNAc-T相比，它們?cè)诎被嵝蛄兴缴洗嬖谝恍┲匾耐蛔?。遺傳進(jìn)化分析顯示，Y亞家族基因僅存在于脊椎動(dòng)物中，有趣的是，它們均失去了體外GalNAc轉(zhuǎn)移活性。對(duì)Y亞家族新成員ppGalNAc-T18的模擬結(jié)構(gòu)分析表明UDP-GalNAc結(jié)合位點(diǎn)的突變可能是導(dǎo)致Y

3、亞家族酶失去催化活性的原因。另外，本文證明ppGalNAc-T18定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而不是高爾基體。我們對(duì)Y亞家族酶的功能進(jìn)行了探討，雖然還沒(méi)有得到最后的結(jié)論，但其成員特殊的表達(dá)定位暗示了該亞家族在脊椎動(dòng)物中發(fā)揮著重要的作用。
　　目前，ppGalNAc-T的底物研究是糖生物學(xué)領(lǐng)域的重要課題之一，它對(duì)揭示O-糖基化的功能具有重大意義。疊氮化糖基轉(zhuǎn)移酶供體底物類(lèi)似物標(biāo)記是一種新的糖基化檢測(cè)方法，疊氮基團(tuán)可與炔基發(fā)生特異的Click反應(yīng)，從

4、而被標(biāo)記炔基的熒光物質(zhì)檢測(cè)。該方法比常用的抗體或凝集素檢測(cè)更加穩(wěn)定且特異。本文結(jié)合疊氮化ppGalNAc-T供體底物類(lèi)似物UDP-GalNAz檢測(cè)手段和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，利用可糖基化多肽芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，最終成功建立了基于蛋白質(zhì)芯片的ppGalNAc-T底物高通量篩選方法，在16000個(gè)蛋白質(zhì)中成功篩選出226個(gè)可能的ppGalNAc-T底物蛋白，其中包括轉(zhuǎn)錄因子、激酶、細(xì)胞內(nèi)吞作用相關(guān)蛋白等。該篩選方法的建立為系統(tǒng)地篩選人類(lèi)2

5、0種ppGalNAc-T的底物提供了有力手段，同時(shí)也為更好地揭示 ppGalNAc-T和O-糖基化在機(jī)體中所發(fā)揮的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　摘要多肽：N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAc-T)是催化 N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)結(jié)合到蛋白質(zhì) Ser或Thr上的糖基轉(zhuǎn)移酶，是粘蛋白型O-糖基化修飾的起始糖基轉(zhuǎn)移酶。ppGalNAc-T是一個(gè)酶家族，人類(lèi)全基因組中共有20個(gè)成員，18個(gè)已被研究報(bào)道，其表達(dá)產(chǎn)物均為Ⅱ型膜蛋白。雖