淀粉樣多肽Aβ40調(diào)節(jié)小腦顆粒細胞GABAAα6表達的機制及發(fā)育成熟的研究.pdf

1、β-淀粉樣多肽最初是在阿爾茲海默病患者腦部淀粉樣斑塊中發(fā)現(xiàn)的，并被命名為β-淀粉樣多肽(β-amyloid peptide，Aβ)。Aβ由淀粉樣蛋白前體蛋白剪切而成，因為蛋白肽鏈長度不一，所以是一類蛋白。檢測到這類蛋白在腦區(qū)堆積是診斷阿爾茲海默癥最有效的手段。研究這類蛋白和阿爾茲海默癥的關(guān)系的文章眾多。研究者發(fā)現(xiàn)淀粉樣能夠使突觸功能紊亂、誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡、促進氧化性脂質(zhì)損傷。但同時研究人員也發(fā)現(xiàn)，淀粉樣多肽同時具有生理功能。據(jù)報道淀粉樣多

2、肽能夠調(diào)控神經(jīng)突觸傳遞;用阻斷劑阻斷淀粉樣多肽的產(chǎn)生會使得神經(jīng)元死亡增加，而在培液中添加淀粉樣多肽后能夠減少細胞的凋亡。但是關(guān)于淀粉樣多肽對神經(jīng)元發(fā)育成熟的調(diào)控的報道卻鮮有涉及。在本人的研究中發(fā)現(xiàn)淀粉樣多肽Aβ40能夠增加GABAAα6的表達，并增加其參與介導(dǎo)的GABA配體門控型Cl-離子電流。此外，通過生物素標記膜蛋白的方法檢測到膜上GABAAα6蛋白的增加。利用western blotting和定量PCR的方法我們檢測到蛋白的增加，

3、但其mRNA水平?jīng)]有變化， cyclohexim ide阻斷蛋白翻譯后發(fā)現(xiàn)Aβ40的作用被抑制，所以我們初步確定Aβ40影響了GABAAα6蛋白的翻譯，但不影響轉(zhuǎn)錄。利用U0126阻斷MEK/ERK信號通路，我們發(fā)現(xiàn)Aβ40的作用被抑制且Aβ40提高ERK1/2磷酸化水平的現(xiàn)象也能被U0126阻斷。利用rapamycin阻斷mTOR信號途徑，發(fā)現(xiàn)同樣能夠抑制Aβ40的作用，且驗證mTOR信號在ERK信號下游。Co-IP實驗揭示Aβ40和

4、膜上p75受體能夠相互作用，p75受體阻斷抗體(blocking antibody)能夠阻斷Aβ40的作用，同時我們發(fā)現(xiàn)阻斷其他幾個能夠和Aβ40相互作用的受體并不能阻斷Aβ40的作用。
　　利用APP基因敲除小鼠，我們檢測了小腦GABAAα6蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)APP基因敲除后，小腦區(qū)域GABAAα6蛋白水平下降，在APP基因敲除小鼠小腦區(qū)域注射Aβ40能夠?qū)ABAAα6蛋白表達水平明顯挽回。由于GABAAα6和小腦顆粒神經(jīng)元的成

5、熟密切相關(guān)，為了進一步研究Aβ40和小腦顆粒發(fā)育成熟的關(guān)系，我們觀察離體培養(yǎng)小腦腦片和APP基因敲除小鼠在Aβ40處理前后小腦形態(tài)學(xué)的變化。我們發(fā)現(xiàn)Aβ40處理的離體培養(yǎng)小腦腦片其外顆粒層比對照組薄，而內(nèi)顆粒層增厚，這個趨勢和小腦發(fā)育成熟過程一致。在APP敲除小鼠模型上，APP敲除組小鼠小腦內(nèi)顆粒層薄且分層不明顯，Aβ40顯微注射小鼠后小腦發(fā)育情況和對照組一致。
　　另外我們還檢測了Aβ40對小腦和小腦顆粒細胞其他發(fā)育情況的影響。

6、利用GFP轉(zhuǎn)染的小腦顆粒細胞拍攝共聚焦顯微照片并經(jīng)三維重構(gòu)后分析發(fā)現(xiàn)，Aβ40處理后小腦顆粒細胞上樹突小棘的分布密度明顯增加。NeuroD2是與神經(jīng)元發(fā)育、分化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它的表達水平與神經(jīng)元的發(fā)育程度密切相關(guān)。定量PCR檢測NeuroD2的mRNA水平發(fā)現(xiàn)，Aβ40能夠在發(fā)育早期(5DIC)增加神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子NeuroD2的轉(zhuǎn)錄。這些線索和GABAAα6的變化一起揭示Aβ40和小腦的發(fā)育密切相關(guān)，有助于我們更深入地了解淀粉樣肽段