源自產(chǎn)堿桿菌DN25降氰酶催化功能的研究.pdf

1、氰水解酶和氰水合酶屬于腈超家族酶，二者均能有效水解氰化氫，但是產(chǎn)物不同(前者為甲酸和氨，后者為甲酰胺)，目前已發(fā)現(xiàn)的兩種酶均來(lái)源不同菌株。本課題組在前期研究中從菌株Alcaligenes sp.DN25中克隆并純化出一氰降解酶(命名為cdE)，水解產(chǎn)物中同時(shí)包含甲酸、氨和甲酰胺。本論文因此對(duì)cdE所表現(xiàn)出來(lái)的雙功能催化作用進(jìn)行探討。
　　首先，采用梯度洗脫純化的方法獲得了純度為97％的cdE，確定其水解反應(yīng)最佳pH和溫度分別為7和

2、30℃，純酶水解氰化鉀的兩種產(chǎn)物(甲酸和甲酰胺)的相對(duì)含量會(huì)受到pH和溫度的影響。無(wú)組氨酸標(biāo)簽cdE水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了組氨酸標(biāo)簽對(duì)cdE的催化特性無(wú)影響。由此認(rèn)為cdE既具有氰水解酶的功能也有氰水合酶的功能。cdE氨基酸序列與源自Pseudomonasstutzeri AK61的氰水解酶的相似度為99％，經(jīng)突變實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析，認(rèn)為兩者催化功能的差異不是由于基因突變引起的。
　　提出cdE的催化機(jī)理為:底物與催化三聯(lián)體Cys163-G

3、lu47-Lys129形成的中間體可同時(shí)以途徑A(表現(xiàn)為氰水解酶功能)和途徑B(表現(xiàn)為氰水合酶功能)完成水解反應(yīng)，且途徑A和途徑B在氰水解過(guò)程中具有選擇性。進(jìn)一步以同源建模和分子對(duì)接技術(shù)為手段，通過(guò)定點(diǎn)突變手段篩選到幾個(gè)對(duì)cdE的催化功能起到重要作用的突變體。這些突變體中除了Trp164Ala、Met162His和Glu136Ala利于甲酰胺的生成，三個(gè)突變體水解產(chǎn)物中甲酰胺和甲酸之比分別是cdE的5.5倍、1.24倍和1.76倍，其余

4、突變體(Met162Ala，Met162Cys, Met162Ser, Met162Glu, Met162Asn, Met162Phe, His166Asn,Ser101Ala)均利于甲酸的生成，突變體水解產(chǎn)物中甲酸和甲酰胺之比分別是cdE的2.9倍、2.8倍、7.8倍、3.2倍、1.8倍、1.3倍、1.7倍和2.8倍;組合突變體(Met162Ala/Ser101Ala, Met162Cys/Ser101Ala)具有一定的組合效果，其水

5、解產(chǎn)物中甲酸和甲酰胺之比分別是cdE的4.9倍和5.1倍。碳端缺失突變體△310和△307的水解產(chǎn)物中甲酸和甲酰胺之比分別是cdE的1.27倍和1.35倍。
　　用Alcaligenes sp.DN25處理某選礦廠含氰廢水，對(duì)總氰的降解率可達(dá)100％(反應(yīng)23h后);選礦礦渣浸出液總氰濃度為8.8mg/L時(shí)，Alcaligenessp.DN25對(duì)總氰的去除效率可達(dá)95％，總氰濃度為5～20mg/L且同時(shí)外加碳源氮源時(shí)，菌株生長(zhǎng)和自