含腈水解酶重組大腸桿菌生物催化1-氰基環(huán)己基乙腈的研究.pdf

1、本文主要研究了含腈水解酶重組大腸桿菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化、催化反應(yīng)條件優(yōu)化以及用海藻酸鈣-戊二醛-聚乙烯亞胺對(duì)含腈水解酶重組大腸桿菌的固定化，并生物催化水解1-氰基環(huán)己基乙腈，高產(chǎn)率的生產(chǎn)有機(jī)合成和醫(yī)藥中間體1-氰基環(huán)己基乙酸。
　　論文的第二章主要采用搖瓶發(fā)酵優(yōu)化的方式，對(duì)含腈水解酶重組大腸桿菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化，研究了培養(yǎng)基組分（碳源、氮源）和發(fā)酵條件（培養(yǎng)溫度、起始 pH值、接種體積分?jǐn)?shù)、搖瓶裝液量、誘導(dǎo)劑IPTG的加入時(shí)

2、間、誘導(dǎo)劑的終濃度、產(chǎn)酶周期)對(duì)產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明：該菌產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)基組分為：蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，NaCl5g/L；最適發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度為30℃，起始 pH值為7.0，接種體積分?jǐn)?shù)為4％，搖瓶裝液量為20%，誘導(dǎo)劑IPTG的加入時(shí)間為4h，誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為0.2mM，發(fā)酵周期為10h，該菌種的腈水解酶活性達(dá)到50.60U/g，較優(yōu)化前提高了很多。
　　論文的第三章，主要是研究了各種條件對(duì)于腈水解酶的催

3、化活性的影響，其中包括有機(jī)溶劑、催化劑細(xì)胞量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及穩(wěn)定性、反應(yīng)pH值及溫度穩(wěn)定性、反應(yīng)體積、底物粒徑、底物抑制試驗(yàn)、產(chǎn)物抑制試驗(yàn)、放置天數(shù)對(duì)酶活影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示酶的催化活性在底物濃度為1mol/L，細(xì)胞量15g/L，在不添加任何助溶劑的pH為7.3的5ml的磷酸鹽緩沖液、30℃反應(yīng)時(shí)轉(zhuǎn)化率較高。且底物粒徑對(duì)反應(yīng)沒有影響，也沒有底物抑制現(xiàn)象，但是通過產(chǎn)物抑制實(shí)驗(yàn)證明該反應(yīng)存在產(chǎn)物抑制。
　　論文的第四章，主要是研究

4、了一種固定化細(xì)胞的方法，即海藻酸鈣-戊二醛-聚乙烯亞胺細(xì)胞固定化法。對(duì)固定化的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最適的工藝條件：包埋細(xì)胞量30g/L，海藻酸鈉濃度是2g/100mL，硬化時(shí)間為12h，戊二醛的濃度為0.1M，聚乙烯亞胺的濃度為0.143mM，分別在這兩種溶液中攪拌20min。之后又考查了固定化細(xì)胞的性質(zhì)并與游離細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的最適溫度分別是70℃和60℃，最適pH分別是8.0和7.3，且固定化細(xì)胞在偏堿性和高

5、溫下的穩(wěn)定性都有所提高。將固定化細(xì)胞儲(chǔ)存在30mM氯化鈣的Tris-HCL緩沖液中4℃保存55天仍有59.7%的酶活，而游離細(xì)胞只有26.67%的酶活。在最終的循環(huán)利用中，當(dāng)二腈底物濃度是0.5M，細(xì)胞量為35g/L時(shí)，可以循環(huán)利用20次轉(zhuǎn)化率仍沒降低，經(jīng)折算產(chǎn)率為每天每升轉(zhuǎn)化生產(chǎn)166.19g1-氰基環(huán)己基乙酸，而游離細(xì)胞循環(huán)5次后轉(zhuǎn)化率開始降低，到第20次后轉(zhuǎn)換率只有6%。并且在循環(huán)反應(yīng)液中添加鈣離子的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，加入鈣離子的循環(huán)反應(yīng)