魚(yú)腥藻毒素(ANTX-a)誘導(dǎo)鯽魚(yú)免疫細(xì)胞毒效應(yīng)及機(jī)理研究.pdf

1、魚(yú)腥藻毒素-a(ANTX-a)，淡水水體中神經(jīng)毒素的代表，在許多國(guó)家水體中爆發(fā)水華時(shí)均有檢測(cè)出。魚(yú)腥藻毒素-a是一種低分子量生物堿，其神經(jīng)毒效應(yīng)及致毒機(jī)理研究的較為透徹，但其他毒性研究相對(duì)較少。本研究以常見(jiàn)水生生物鯽魚(yú)的免疫細(xì)胞作為研究對(duì)象，魚(yú)腥藻毒素-a為目標(biāo)污染物，采用體外暴露方法，暴露濃度為0.01，0.1，1，10 mg/L，時(shí)間為12h。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率、透射電鏡觀察結(jié)構(gòu)變化和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA斷裂情況來(lái)研究魚(yú)腥

2、藻毒素-a對(duì)鯽魚(yú)免疫細(xì)胞的毒效應(yīng)。并在此基礎(chǔ)上，從抗氧化系統(tǒng)和死亡通路兩大方面來(lái)探討ANTX-a對(duì)水生生物鯽魚(yú)免疫毒性的分子機(jī)理。
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:0.01-10 mg/L的魚(yú)腥藻毒素-a(ANTX-a)可誘導(dǎo)鯽魚(yú)免疫細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡率分別為18.89％，22.89％，39.23％和35.58％，同時(shí)，ANTX-a可導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，分裂速度減慢;透射電鏡觀察結(jié)果表明:和對(duì)照組相比，10 mg/L的ANTX-a可誘導(dǎo)

3、鯽魚(yú)免疫細(xì)胞出現(xiàn)“空泡化”，細(xì)胞核發(fā)生形變，線(xiàn)粒體腫脹;DNA-ladder凝膠電泳結(jié)果顯示:ANTX-a可誘導(dǎo)鯽魚(yú)免疫細(xì)胞內(nèi)DNA發(fā)生斷裂。由此說(shuō)明，ANTX-a對(duì)水生生物鯽魚(yú)的免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生影響。
　　免疫細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示:魚(yú)腥藻毒素提高了活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平，降低了超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，同時(shí)降低了谷胱甘肽還原酶(GR)、過(guò)氧化物酶(GPX)與S-轉(zhuǎn)移酶(GS

4、T)的活性，增加了谷胱甘肽(GSH)含量，說(shuō)明ANTX-a破壞了鯽魚(yú)免疫細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡，誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)（Real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)結(jié)果顯示:ANTX-a可誘導(dǎo)鯽魚(yú)免疫細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體膜電位下降，細(xì)胞色素c氧化酶(COX) mRNA表達(dá)量水平降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的基因表達(dá)量下降，促凋亡蛋白B

5、AX基因表達(dá)量上升，從而導(dǎo)致細(xì)胞半胱天冬蛋白酶caspase-9和cleaved-Caspase-3表達(dá)量上升，說(shuō)明ANTX-a誘導(dǎo)鯽魚(yú)免疫細(xì)胞凋亡與線(xiàn)粒體凋亡通路相關(guān);對(duì)腫瘤壞死因子（TNF-α）受體通路相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，0.01-10 mg/L的ANTX-a下調(diào)了TNF-α的mRNA表達(dá)量，增加了下游指標(biāo)受體相關(guān)絲氨酸-蘇氨酸激酶（RIP3）、磷酸甘油酸變位酶(PGAM5)和底物蛋白激酶(MLKL)的蛋白表達(dá)量，卻下調(diào)了磷酸化的IK

6、Kα和IKKβ的蛋白表達(dá)量，與此同時(shí)，p-NF-κB在ANTX-a為0.01-1 mg/L時(shí)上調(diào)，在最高濃度時(shí)下降，而這很有可能與細(xì)胞死亡的方式有關(guān)。綜上所述，0.01-10 mg/L的神經(jīng)毒素-魚(yú)腥藻毒素-a可破壞鯽魚(yú)免疫細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡，誘導(dǎo)鯽魚(yú)免疫細(xì)胞發(fā)生凋亡，而這與線(xiàn)粒體凋亡通路和TNF-α受體通路相關(guān)，而10 mg/L的ANTX-a可能導(dǎo)致免疫細(xì)胞發(fā)生壞死，說(shuō)明魚(yú)腥藻毒素-a不僅具有明顯的神經(jīng)毒性，同時(shí)對(duì)水生生物的免疫系