新型功能化整體柱的制備、應(yīng)用和分離識(shí)別機(jī)理的研究.pdf

1、整體柱(monolithic column)又稱為連續(xù)床(continuous bed),是由單體、交聯(lián)劑、致孔劑以及引發(fā)劑的混合溶液在色譜柱內(nèi)通過(guò)原位熱引發(fā)或光引發(fā)聚合得到的整體、連續(xù)的柱體。相對(duì)于常規(guī)填充柱,具有制備簡(jiǎn)單、易于改性、滲透性好、柱壓低、傳質(zhì)速度快和分離效率高等優(yōu)點(diǎn)。本論文合成了聚甲基丙烯酸縮水甘油酯poly(GMA-co—EGDMA)和聚甲基丙烯酸異氰基乙酯poly(IEM-co-MMA—co—EGDMA)整體柱聚合物

2、骨架材料,通過(guò)鍵合碳鏈(C8-C18)疏水配基、聚乙烯亞胺(PEI)陰離子交換配基和β-環(huán)糊精(β-CD)配基,對(duì)骨架材料進(jìn)行功能化修飾。實(shí)現(xiàn)了對(duì)天然產(chǎn)物葛根黃酮粗提物、解脂假絲酵母脂肪酶和布洛芬手性藥物的分離純化。研究了整體柱的分離識(shí)別機(jī)理,并利用計(jì)算機(jī)模擬和核磁共振技術(shù)探討了β-環(huán)糊精的超分子識(shí)別機(jī)理。
　　 鑒于分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technology,MIT)的專一識(shí)別性能和固相萃取技

3、術(shù)(Solid phase extraction,SPE)的高效預(yù)富集能力,本論文還利用分子印跡固相萃取(Molecular imprinting solidphase extraction,MISPE)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)茶葉中殘留的痕量有機(jī)磷農(nóng)藥樂(lè)果的快速富集與分離。優(yōu)化了分子印跡聚合物(Molecularlyimprinted polymers,MIPs)的合成條件,建立了等溫吸附模型,研究了MISPE對(duì)目標(biāo)分子的萃取效率,并利用計(jì)算機(jī)模

4、擬構(gòu)建模型,探討了MIPs的特異選擇識(shí)別性能。論文的主要工作如下:
　　 1、合成C8疏水配基鍵合聚甲基丙烯酸縮水甘油酯poly(GMA-co-EGDMA)整體柱,通過(guò)一步色譜,分離純化葛根黃酮中的葛根素,研究葛根素、大豆甙和大豆苷元的分離識(shí)別機(jī)理。采用甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)為功能單體,二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)為交聯(lián)劑,GMA:EGDMA=8:2(v／v),偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑,環(huán)己醇:十二醇=87

5、:13(v／v)為致孔劑,直接以不銹鋼柱管為模具,55℃自由基熱聚合制備poly(GMA-co-EGDMA)整體柱聚合物骨架介質(zhì)。在55℃下,利用50％(v／v)的正辛胺乙醇溶液修飾整體柱,合成C8疏水配基鍵合poly(GMA-co-EGDMA)整體柱。介質(zhì)的孔隙率為60.8％,比表面積為1.7.8 m2·g-1,平均孔徑為0.76μm。對(duì)葛根素的動(dòng)態(tài)飽和吸附容量為15 mg·g-1,C8配基密度為2.3 mmol·g-1。從葛根黃酮粗

6、提物中一步分離純化得到葛根素的最佳流動(dòng)相為1％(v％)的醋酸水溶液,等梯度洗脫。組分的定性由紅外光譜分析(FTIR)、LC-MS和NMR完成。樣品在最大負(fù)載量11.6 mg每克干樹(shù)脂下,一步色譜純化得到的葛根素的收率和純度分別為95％和69％(m％)。整體柱介質(zhì)在多次使用后,利用100％的甲醇以0.5 mL·min-1的流速連續(xù)沖洗1 h,介質(zhì)可以再生。
　　 結(jié)合混合溶劑下的色譜分析和計(jì)算機(jī)模擬研究葛根素、大豆甙和大豆苷元在C

7、8疏水配基整體柱上的分離識(shí)別機(jī)理。通過(guò)改變色譜流動(dòng)相中添加劑的濃度,證明了氫鍵作用和疏水作用的存在。底物在C8疏水配基整體柱上的保留符合氫鍵和疏水共存的混合作用模式。計(jì)算模擬結(jié)果表明,聚合物骨架和仲胺功能基團(tuán)均與底物形成很強(qiáng)的氫鍵,氫鍵的受體為羰基和羧基,氫鍵的給體為羥基和仲胺基團(tuán)。而C8配基與底物的芳香環(huán)有很強(qiáng)的疏水作用。通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算底物和聚合物的結(jié)合能,可以成功地預(yù)測(cè)底物在整體柱上的保留行為。
　　 2、合成聚乙烯

8、亞胺(PEI)高聚物陰離子交換配基鍵合poly(GMA-co-EGDMA)整體柱,通過(guò)一步色譜,分離純化解脂假絲酵母脂肪酶(YlLip2)。確定整體柱的最佳合成條件,PEI的分子量30 kDa,PEI的修飾濃度為10％(wt％),修飾溫度為55℃,修飾時(shí)間為12 h。介質(zhì)的孔隙率為65.6％,比表面積為5.8 m2·g-1,平均孔徑為1.8μm。對(duì)BSA的動(dòng)態(tài)吸附容量為45.2 mg·g-1,PEI配基密度(按N元素計(jì)算)為31.8μm

9、ol·g-1。一步色譜分離純化,從脂肪酶粗酶液中分離得到四種同工酶。非變性電泳分析顯示,四種同工酶成分均一,分子量相當(dāng),約為38 kDa。層析的酶活力總收率為52.2％。四種同工酶的最大純化倍數(shù)為4.5,酶活比活力最大值達(dá)到3860U·mg-1。圓二色(CD)光譜分析各組分的二級(jí)結(jié)構(gòu),酶結(jié)構(gòu)顯示了α／β水解酶折疊的特點(diǎn),各組分間的二級(jí)特征結(jié)構(gòu)的比例差異較小,無(wú)規(guī)則卷曲都約為30％。MALDI-TOF-MS表征同工酶A,B,C和D的分子量

10、分別為36648±36、37839±33、38236±31和38795±96Da。
　　 3、合成β-環(huán)糊精配基鍵合poly(GMA-co-EGDMA)整體柱,手性拆分布洛芬對(duì)映體,研究β-CD與布洛芬超分子手性識(shí)別的包絡(luò)機(jī)理。整體柱的最佳合成條件確定為:0.2 M Na2CO3(pH=12)為修飾反應(yīng)溶劑,EDA-β-CD的修飾濃度為20％(wt％),修飾反應(yīng)溫度為60℃。介質(zhì)的孔隙率為65.6％,比表面積為5.1 m2·g-

11、1,平均孔徑為1.1μm。β-CD配基的鍵合量為680μmol·g-1。確定手性拆分布洛芬的最佳流動(dòng)相為甲醇／0.5％TEAA=30／70(v／v)(pH=4),等梯度洗脫,對(duì)布洛芬對(duì)映體的分離度為2.0,選擇性因子為6.1。分析級(jí)實(shí)驗(yàn)中,一步分離純化從葛根黃酮中得到葛根素,純度為86％(m％),收率為79％(m％),分離效率略遜于C8疏水配基整體柱。
　　 布洛芬與β-CD超分子手性識(shí)別的包絡(luò)機(jī)理是P-N作用機(jī)理,即形成包合物

12、后,布洛芬的苯環(huán)完全被包絡(luò)在β-CD的疏水內(nèi)腔中,而布洛芬的羧基極性端位于β-CD的小口端。結(jié)合能、氫鍵相互作用和對(duì)映體分子的競(jìng)爭(zhēng)性吸附結(jié)果表明,S-布洛芬與β-CD形成的包合物相對(duì)更穩(wěn)定,色譜洗脫過(guò)程中S-布洛芬后洗脫出來(lái),與色譜手性拆分的結(jié)果一致。相對(duì)于游離態(tài)的β-CD,鍵合后的β-CD對(duì)布洛芬對(duì)映體的選擇性增加,手性拆分效率提高。
　　 4、合成新型的、具有高反應(yīng)活性和通用性的聚甲基丙烯酸異氰基乙酯poly(IEM-co-

13、MMA-co-EGDMA)整體柱骨架材料,鍵合碳鏈(C8-C18)疏水配基和β-環(huán)糊精配基,通過(guò)一步色譜,分離純化葛根黃酮中的葛根素。甲基丙烯酸異氰基乙酯(IEM)為功能單體,甲基丙烯酸甲酯(MMA)為共聚單體,二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)為交聯(lián)劑,IEM:MMA:EGDMA=12:1:1(摩爾比),偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑,甲苯／正庚烷=0.5／1(v／v)為致孔劑。介質(zhì)的孔隙率為57.6％,比表面積為11.5 m2·g

14、-1,平均孔徑為1.6μm。整體柱配基有效鍵合的定性分析由FTIR、固體核磁共振光譜和X光電子能譜(XPS)完成。由整體柱修飾反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線計(jì)算配基的飽和鍵合密度,C8配基鍵合密度高達(dá)2.33 mmol·mL-1,異氰酸酯(N=C=O)基團(tuán)的轉(zhuǎn)化率為96.9％。
　　 5、色譜分析、計(jì)算機(jī)模擬和核磁共振技術(shù)結(jié)合研究葛根素、大豆甙和大豆苷元在β-環(huán)糊精配基整體柱上的分離識(shí)別機(jī)理。分子模擬結(jié)果顯示,葛根素與β-CD的結(jié)合能最小,大

15、豆苷元與β—CD的結(jié)合能最大。相對(duì)應(yīng)在色譜分析中,葛根素在β-環(huán)糊精配基整體柱上的保留因子最小,大豆苷元的保留因子最大。β-CD與客體分子的結(jié)合能越大,表明β-CD與客體小分子的結(jié)合作用越大,形成的包合物相對(duì)越穩(wěn)定,則在色譜分離中客體分子在固定相上的保留因子越大,在洗脫順序中表現(xiàn)為后洗脫出來(lái)。通過(guò)模擬計(jì)算β-CD與客體分子的結(jié)合能的大小,可以成功地預(yù)測(cè)客體小分子在β-環(huán)糊精配基整體柱上的保留行為和洗脫順序。空白整體柱骨架聚合物對(duì)三種底物

16、沒(méi)有選擇性,配基β-CD起到主要作用。通過(guò)改變色譜流動(dòng)相添加劑的濃度,證明了葛根素、大豆甙和大豆苷元在β-CD配基整體柱上的保留符合氫鍵和疏水作用共存的混合作用模式。由1H NMR和2D ROESYNMR證明,絡(luò)合機(jī)理是葛根素的B環(huán)、C環(huán)和A環(huán)從β-CD的大口端進(jìn)入環(huán)糊精的疏水內(nèi)腔中,與β-CD形成1:1的絡(luò)合物。NMR分析結(jié)果與分子模擬結(jié)果一致。
　　 6、分子印跡固相萃取技術(shù)快速富集分離茶葉中殘留的痕量有機(jī)磷農(nóng)藥樂(lè)果。計(jì)算機(jī)

17、模擬和色譜分析結(jié)合篩選分子印跡體系,最佳條件確定為:甲基丙烯酸丁酯(BMA)為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯(lián)劑,四氫呋喃(THF)為致孔劑,模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的摩爾比為1:4:20,聚合溫度為60℃,聚合時(shí)間為24 h,引發(fā)劑AIBN的用量為1％(相對(duì)于單體體積質(zhì)量比)。MIPs對(duì)其模板分子樂(lè)果表現(xiàn)出很高的專一識(shí)別性能,其吸附等溫線符合Langmuir模型。分子印跡固相萃取茶葉中的樂(lè)果的回收率可以達(dá)到99％,

18、富集倍數(shù)為100倍,而空白聚合物對(duì)樂(lè)果的回收率僅有26％。分子動(dòng)力學(xué)模擬構(gòu)建模型,通過(guò)定義IFindicator和CFindicator兩個(gè)參數(shù),反映MIPs對(duì)樂(lè)果及其結(jié)構(gòu)類似物的特異選擇性能。IFindicator越大,MIPs對(duì)其選擇性越好；CFindicator越大,結(jié)構(gòu)類似物與樂(lè)果的結(jié)構(gòu)差異越大,則MIPs對(duì)其選擇性越差。吸附溶劑對(duì)聚合物和底物的作用力越小,溶劑之間的作用力越大,則有利于聚合物與底物的靠攏,聚合物與底物間的作用力