鈴蟾肽標(biāo)記的氧化釓納米微粒的制備及其靶向成像實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　前列腺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的一種惡性腫瘤，在歐美男性中高發(fā)，據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2014年，男性腫瘤患者中，前列腺癌發(fā)病率居第一，為27％。前列腺癌早期癥狀不明顯或者沒(méi)有特異性，早期診斷困難，而早期診斷對(duì)治療效果和預(yù)后有著重要意義，目前主要通過(guò)直腸指診、前列腺特異性抗原生化指標(biāo)，影像學(xué)檢查方法如超聲，CT和磁共振來(lái)做出診斷，目前的檢查方法對(duì)于早期診斷的敏感性和特異性不足，確診時(shí)多已為晚期。早期診斷對(duì)成像技術(shù)和方法提出了

2、更高的要求。
　　近年來(lái)，分子影像學(xué)和納米技術(shù)的進(jìn)步使得多模態(tài)的納米材料有了較快的發(fā)展，可用于腫瘤的發(fā)現(xiàn)、診斷和治療。特異性分子靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、高親和力分子探針的設(shè)計(jì)及合成是推動(dòng)分子影像學(xué)發(fā)展的動(dòng)力。另外，由于腫瘤組織血管結(jié)構(gòu)不同而引起的增強(qiáng)的通透性及滯留效應(yīng)(EPR)，有利于納米材料在腫瘤組織的富集。理想的分子探針為特異性強(qiáng)、成像質(zhì)量好，對(duì)比度高，生物安全性好的納米材料。
　　胃泌素釋放肽受體(Gastrin releasin

3、g peptide receptor，GRPr)是一種G蛋白偶聯(lián)受體，在前列腺癌細(xì)胞，乳腺癌細(xì)胞等許多腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)。GRPr在前列腺癌細(xì)胞表面高表達(dá)，而正常前列腺細(xì)胞和良性前列腺增生組織則不表達(dá)GRPr。鈴蟾肽(bombesin，BBN)，是一個(gè)含有14個(gè)氨基酸殘基的多肽，由于其與27肽的胃泌素釋放肽的有著相似的結(jié)構(gòu)，因此對(duì)于GRPr有著很高的親和力和特異性?？梢杂米鞣肿佑跋駥W(xué)的一個(gè)靶點(diǎn)。目前BBN及其類似物已經(jīng)開(kāi)始用于GRPr陽(yáng)

4、性的腫瘤的研究。
　　氧化釓納米顆粒，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有應(yīng)用，由于其實(shí)是順磁性物質(zhì)，可以是縮短T1弛豫時(shí)間，可作為MR陽(yáng)性對(duì)比劑，在增強(qiáng)對(duì)比度的同時(shí)還可以與多種配體連接，可用于多模態(tài)活體成像。在本研究中，我們嘗試合成以GRPr為靶點(diǎn)，鈴蟾肽BBN修飾、帶熒光標(biāo)記的順磁性雙模態(tài)納米微粒Gd2O3-FI-PEG-BBN，并且對(duì)所制備的Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒的理化特性、細(xì)胞毒性、體外主動(dòng)靶向PC-3細(xì)胞以及體內(nèi)MR成像

5、的效果等進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，通過(guò)表面修飾使納米微粒能同時(shí)發(fā)揮順磁性及熒光對(duì)比劑的作用，可實(shí)現(xiàn)光學(xué)-MR雙模態(tài)成像的對(duì)比增強(qiáng)，有利于早期診斷前列腺腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶，也為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)藥物療效與體內(nèi)分布情況等探索新的途徑。
　　目的:
　　1.制備鈴蟾肽和熒光素雙標(biāo)記的氧化釓納米微粒Gd2O3-FI-PEG-BBN，來(lái)作為一種靶向的MRI對(duì)比劑，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定和評(píng)價(jià)。
　　2.培養(yǎng)胃泌素釋放肽受體(GRPr)陽(yáng)性的人前列腺癌細(xì)

6、胞系PC-3，評(píng)價(jià)Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒的細(xì)胞毒性和體外靶向前列腺癌細(xì)胞的有效性。
　　3.制備前列腺癌荷瘤裸鼠模型，探討Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒活體腫瘤靶向成像的可能性和體內(nèi)成像的特點(diǎn)
　　材料和方法:
　　1.合成和評(píng)價(jià)
　　1.1 合成
　　1.1.1 Gd2O3納米微粒的制備:
　　取Gd(OAC)3(670mg，2mmol)溶解在30mLDMSO中，攪拌均勻

7、后緩慢滴加四甲基氫氧化銨(TMAH，200mg，5.6mmol)和10mL無(wú)水乙醇混合物。溶液室溫下攪拌2h后離心分離，固體用乙醇洗滌三次得到Gd2O3。
　　1.1.2 Gd2O3-FI的制備:
　　取Gd2O3(400mg)分散在DMSO中，加入5(6)-羧基熒光素(100mg)，室溫下攪拌12h后離心分離，固體分別用DMSO，乙醇和二氯甲烷洗滌三次得到熒光素表面修飾的Gd2O3。
　　1.1.3 Gd2O3-FI

8、-PEG的制備:
　　取Gd2O3-FI(200mg)分散在DMSO中，加入a-羧基，w-羥基聚乙二醇（分子量2000）(100mg)，室溫下攪拌12h后離心分離，固體分別用DMSO，乙醇和二氯甲烷洗滌三次得到PEG和熒光素表面修飾的Gd2O3。
　　1.1.4 Gd2O3-FI-PEG-BBN的制備:
　　采用傳統(tǒng)的FMOC固相合成方法合成的鈴蟾肽BBN(7-14)，取Gd2O3-FI-PEG(100mg)分散在DM

9、SO中，加入BBN(20mg)，EDC.HCl(20mg)和4-二甲氨基吡啶DMAP(10mg)，室溫下攪拌12h后離心分離，固體分別用DMSO，乙醇和二氯甲烷洗滌三次得到攜BBN、PEG和熒光素表面修飾的Gd2O3。
　　1.2評(píng)價(jià)和表征
　　1.2.1 采用TEM觀察Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒形態(tài)、大小
　　Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒用去離子水稀釋后，滴于敷有雙面支撐膜的銅網(wǎng)上，靜置約5

10、分鐘后，用濾紙小片從銅網(wǎng)邊緣吸干多余液體，靜置干燥后，置透射電子顯微鏡下觀察納米微粒子的大小和形態(tài)。
　　1.2.2 采用Malvem-3000HS激光粒度分析儀進(jìn)行納米微粒粒徑及分布的測(cè)定用Malvem Zetasizer3000HS激光散射粒度分析測(cè)定Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒的粒徑及分布，取5ul，用蒸餾水稀釋至測(cè)量杯中，放入樣品槽中測(cè)試。
　　1.2.3 傅里葉變換紅外光譜分析儀(FTIR)分析Gd2O

11、3 and Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒的紅外光譜
　　將Gd2O3納米微粒、Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒懸液滴在硒化鋅窗片上，吹干，用FTIR儀掃描，掃描范圍為4000-400cm-1。
　　2.Gd2O3-FI-PEG-BBN腫瘤靶向體外實(shí)驗(yàn)研究
　　選用的GRPr表達(dá)陽(yáng)性的人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3來(lái)自美國(guó)ATCC，用含10％胎牛血清、1％青霉素和鏈霉素雙抗的的DMEM高糖培養(yǎng)液，放入5％C

12、O2、37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞備用。
　　2.1 Gd2O3-FI-PEG-BBN體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
　　通過(guò)MTT法和PC-3細(xì)胞來(lái)檢測(cè)Gd2O3-FI-PEG和Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒的毒性。接種3000個(gè)PC-3細(xì)胞/孔于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)過(guò)夜。細(xì)胞已貼壁，吸去培養(yǎng)液，每孔加入經(jīng)0.45um過(guò)濾器濾過(guò)除菌的Gd2O3-FI-PEG或Gd2O3--FI-PEG-BBN納米微粒培養(yǎng)基懸

13、液，設(shè)6個(gè)濃度梯度，分別為每孔含Gd0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，僅含培養(yǎng)基無(wú)細(xì)胞的6個(gè)孔作為調(diào)零孔，含等量細(xì)胞的不加藥的完全培養(yǎng)基的6個(gè)孔作為對(duì)照組。分別培養(yǎng)24h和48h后，加MTT(5mg/mL)溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸除培養(yǎng)液，每孔加入150ul DMSO，平板震蕩儀震蕩10min，在酶標(biāo)儀(ELX80，BIOTEK，USA)中測(cè)定490nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD

14、值)，按照此公式計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(％)=（實(shí)驗(yàn)孔OD值-調(diào)零孔OD值）/（對(duì)照孔OD值-調(diào)零孔OD值）×100％。
　　2.2 體外靶向攝取實(shí)驗(yàn)
　　2.2.1 熒光顯微鏡觀察靶向攝取實(shí)驗(yàn)
　　將PC-3細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，以4×105個(gè)/每孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，在5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，吸去培養(yǎng)液，分為3組，每組2孔，實(shí)驗(yàn)組每孔加入溶有Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒（

15、含Gd0.8 mmol/L）的DMEM完全培養(yǎng)液2ml，對(duì)照組每孔加入溶有Gd2O3-FI-PEG納米微粒(含Gd0.8 mmol/L)的DMEM完全培養(yǎng)液2ml，空白對(duì)照組每孔加入DMEM完全培養(yǎng)液2ml，繼續(xù)孵育4h后，吸去上清培養(yǎng)液，再用PBS液洗滌三遍，每孔加入4％多聚甲醛溶液0.5ml，固定15min后，用PBS液洗三遍，每孔加入DAPI染液100ul，室溫下染3-5min后用PBS液洗三遍，每孔滴加約100ul的PBS液，倒

16、置熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記成功率。
　　3.Gd2O3-FI-PEG-BBN腫瘤靶向體內(nèi)成像研究
　　3.1 建立前列腺癌荷瘤裸鼠模型
　　在無(wú)菌條件下，將含有6×106個(gè)PC-3細(xì)胞的150μL細(xì)胞懸液注射入裸鼠的右側(cè)肩背部皮下，約30天后，腫瘤直徑達(dá)到1.0-2.0cm，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（靶向組）和對(duì)照組（非靶向組），備用。
　　結(jié)果:
　　1制備和評(píng)價(jià)
　　1.1 TEM觀察Gd2O3-FI-PEG-

17、BBN納米微粒形態(tài)、大小
　　Gd2O3-FI-PEG-BBN在透射電子顯微鏡下粒子呈球形，大小均勻，僅有少量聚集現(xiàn)象，分布較均勻，電子顯微鏡下估算其平均粒徑大小約50-60nm。
　　1.2 Malvem-3000HS激光粒度分析儀進(jìn)行納米微粒粒徑及分布的測(cè)定
　　Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒通過(guò)Malvern-3000HS激光粒度分析儀來(lái)測(cè)定，Gd2O3-FI-PEG-BBN納米微粒粒徑分布集中，峰數(shù)為

18、1，平均粒徑約為90nm。
　　2.Gd2O3-FI-PEG-BBN腫瘤靶向體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究
　　3.Gd2O3-FI-PEG-BBN腫瘤靶向體內(nèi)成像研究
　　結(jié)論:
　　本研究成功制備了鈴蟾肽BBN和熒光素FI雙標(biāo)記的氧化釓納米顆粒Gd2O3-FI-PEG-BBN分子探針，有較好的水溶性、生物相容性、熒光顯像及MRIT1增強(qiáng)效果好，能選擇性地在前列腺癌腫瘤組織富集，能有效進(jìn)行熒光顯像和MR成像，可用于光學(xué)-MR