RGD修飾的蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒的制備及其治療大腸癌的機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　 建立具有主動(dòng)靶向和緩釋作用的蟾毒靈載藥納米粒的制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；探討其藥物釋放規(guī)律、體內(nèi)外藥物靶向分布、對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用和對(duì)裸鼠結(jié)腸癌的治療作用，揭示其藥理學(xué)機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒制備方法：選用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、多聚左旋賴氨酸(PLL)為載體材料與RGD共修飾，采用乳化溶劑蒸發(fā)法，建立RGD修飾的蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒(BufalinN

2、anoparticles，BNP)的制備方法，先后考察了7個(gè)因素對(duì)納米粒形成的影響，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了BNP的制備工藝。
　　 對(duì)蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒的有關(guān)理化性質(zhì)進(jìn)行研究：掃描電鏡照片評(píng)價(jià)納米微粒表面結(jié)構(gòu)；光學(xué)顯微鏡觀察納米粒的粒徑分布；檢測(cè)蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒的包封率、載藥量等，并觀察體外藥物釋放規(guī)律。
　　 蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒靶向分布實(shí)驗(yàn)：Rb做熒光探針包裹于納米粒中，激光共聚焦顯微鏡下觀察攝入到細(xì)胞中納米粒的分

3、布情況；活體成像儀對(duì)荷SW620腸癌小鼠進(jìn)行活體靶向熒光成像，觀察載藥納米粒的體內(nèi)分布情況。
　　 蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)：CCK-8法觀察BNP細(xì)胞毒性，以及對(duì)人腸癌SW620細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用。
　　 蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒治療裸鼠腸癌的作用：建立裸鼠移植性腸癌模型并隨機(jī)分為如下六組分別經(jīng)尾靜脈給藥：對(duì)照組(生理鹽水，NS，13.5ml/kg)；蟾毒靈組(Bufalin，1mg/kg)；mPEG-PLGA

4、-PLL納米組(mPEG-PLGA-PLLNPs，24.5mg/kg)；mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米組(mPEG-PLGA-PLL-cRGDNPs，24.5mg/kg)；蟾毒靈mPEG-PLGA-PLL納米組(bufalin-mPEG-PLGA-PLL，含藥1mg/kg)；mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米組(bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD，含藥1mg/kg)。比較治療后各組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況、腫

5、瘤壞死程度和生存時(shí)間。
　　 結(jié)果：
　　 蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒的制備及有關(guān)理化性質(zhì)：以乳化溶劑蒸發(fā)法制備的蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒，納米粒大小均勻，外形圓整，平均粒徑為164±84nm，Zeta電位為2.77mv，包封率和載藥量分別為81.7±0.89％、3.92±0.16％。制成納米制劑后與游離的蟾毒靈單體相比釋放速度明顯減慢，在24小時(shí)后，游離的蟾毒靈單體釋放已達(dá)90％，而蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒釋放僅為50％，蟾毒靈多級(jí)

6、靶向納米粒在192小時(shí)后釋放達(dá)90％。
　　 藥物分布研究：用Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL納米粒培養(yǎng)的HUVECs的熒光強(qiáng)度，要明顯低于用Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒培養(yǎng)的HUVECs的熒光強(qiáng)度。靜脈給藥后4小時(shí)，與Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL納米粒相比，注射Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒的荷瘤裸鼠腫瘤部位的熒光強(qiáng)度要強(qiáng)

7、，但差別不明顯。靜脈給藥后24小時(shí)，注射Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒的荷瘤裸鼠腫瘤的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。而且與Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL納米粒相比，注射Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒的荷瘤裸鼠腫瘤部位顯示出較高的熒光強(qiáng)度。
　　 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)：CCK-8比色法觀察SW620細(xì)胞生存率，隨著濃度的增加，mPEG-PLGA-PLL和mPEG-

8、PLGA-PLL-cRGD空白納米粒的細(xì)胞生存率在96％到90％之間，無(wú)明顯變化，與Bufalin相比，載Bufalin納米粒的細(xì)胞毒性明顯增加。從BNP中釋放的Bufalin對(duì)人腸癌SW260細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制率均有顯著的抑制作用，其作用與劑量和作用時(shí)間成正相關(guān)。
　　 蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒治療裸鼠腸癌的作用：治療后蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒與等劑量蟾毒靈相比，對(duì)裸鼠腸癌腫瘤生長(zhǎng)抑制更明顯，生存期更長(zhǎng)。
　　 結(jié)論：
　

9、　 1.本研究采用乳化蒸發(fā)法建立了RGD修飾的蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒制備方法、質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。
　　 2.與蟾毒靈相比，蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒隨著時(shí)間的延長(zhǎng)能夠?qū)⑺幬镏鸩结尫懦鰜?lái)，在384小時(shí)累積釋放量為(31.77±2.08)％，具有良好的緩釋特征。
　　 3.Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒的細(xì)胞攝取效率要明顯高于Rb-bufalin-mPEG-PLGA-PLL納米粒，活體熒光成像顯示Rb

10、-bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒能更有效地靶向腫瘤，這表明RGD修飾的蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒具有較好的腫瘤靶向作用。
　　 4.mPEG-PLGA-PLL和mPEG-PLGA-PLL-cRGD空白納米粒的細(xì)胞生存率在96％到90％之間，表明載體材料其基本無(wú)毒性。與Bufalin相比，載Bufalin納米粒的細(xì)胞毒性明顯增加，表明蟾毒靈多級(jí)靶向納米粒能有效提高Bufalin的細(xì)胞毒性，這將有助于提高腫瘤治