金魚（Carassius auratus）卵黃原蛋白mRNA特性及其在環(huán)境雌激素篩選中的應(yīng)用.pdf

1、卵黃原蛋白(Vitellogenin，VTG)是檢測水環(huán)境雌激素的重要生物標(biāo)志物。雄性魚類VTG mRNA是一種檢測環(huán)境雌激素的新興生物標(biāo)志物。我國水環(huán)境生物監(jiān)測主要采用傳統(tǒng)的群落學(xué)方法和生物化學(xué)檢測，應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測水環(huán)境雌激素的報道較少。久效磷(Monocrotophos，MCP)是一種常用的有機磷農(nóng)藥，已經(jīng)在我國造成了嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留污染。本文選用在我國廣泛分布的魚類——金魚作為模式生物，研究久效磷對雄性金魚VTG mRNA表

2、達(dá)的影響。 實驗室邴欣等已成功分離純化17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)暴露的雄性金魚血清VTG：用非變性聚丙烯酰胺電泳(PAGE)測得VTG的分子量約為440kDa；用Western-blot技術(shù)證明在0.01 mg·L-1、0.10 mg·L-1、1.00mg·L-1三個久效磷濃度暴露組都能夠誘導(dǎo)雄性金魚分泌VTG。基于實驗室已經(jīng)完成的工作，本文采用RT-PCR檢測金魚VTG mRNA的表達(dá)，克隆編碼金魚V

3、TG蛋白的部分cDNA片段，并以此為模板制備地高辛標(biāo)記的RNA探針，用這種分子生物學(xué)技術(shù)檢測環(huán)境雌激素對金魚的雌激素效應(yīng)，建立了新的篩選環(huán)境雌激素的分子生物學(xué)方法。 實驗所用金魚購自青島南山花鳥市場，馴養(yǎng)兩周后開始實驗。取雌魚肝臟提取總RNA，根據(jù)已知氨基酸序列的魚種設(shè)計兼并引物，RT-PCR擴增金魚VTG基因片段，得到一條1135bp的特異性條帶。將所得DNA進(jìn)行測序，其序列用NCBI的Blast進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，擴增所得

4、片段與鯉魚(Cyprinus carpio)的同源性為94％，與金魚(Carassius auratus)同源性為93％，與鰷魚(Pimephales promelas)同源性為90％，并且在系統(tǒng)發(fā)生樹中與金魚最為接近，由此可以初步認(rèn)為這段序列是編碼金魚VTG的基因序列。 為了進(jìn)一步驗證這段序列就是編碼金魚VTG的基因序列，同時建立檢測環(huán)境雌激素的新方法，將所得片段轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行增殖，提取質(zhì)粒，內(nèi)切酶SphI將質(zhì)粒線性化，純

5、化得到高純的線性DNA。選取Sp6 RNA聚合酶，以DNA為模板合成DIG標(biāo)記的cRNA探針。用所得探針(615bp)進(jìn)行Northern雜交實驗，結(jié)果顯示，0.01 mg L-1、0.10 mg L-1和1.00 mg L-1三個久效磷濃度組表達(dá)了與每條魚0.2μg的17-β雌二醇暴露的金魚相同大小的VTG mRNA。證明魚類在久效磷誘導(dǎo)下能夠產(chǎn)生與內(nèi)源雌激素刺激下相同的VTG基因，進(jìn)一步驗證了久效磷是一種環(huán)境雌激素。本實驗建立了RT