壬基酚（4-Nonylphenol）和雙酚A（Bisphenol A）對鯽（Carassius auratus）原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的毒性及雌激素效應(yīng).pdf

1、目前，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)對人類和野生生物的有害影響引起了許多國際組織和世界各國政府的關(guān)注，成為本世紀(jì)生命科學(xué)和環(huán)境科學(xué)的重大議題之一。對EDCs內(nèi)分泌擾亂研究，在陸生動物方面主要集中在雄性或雌性動物生殖功能的影響、癌癥細(xì)胞的增殖效應(yīng)等方面；在水生動物研究方面，主要集中在對魚類的氧化毒性和雌激素效應(yīng)以及蛋白生物標(biāo)志物上。對壬基酚(4-Nonylphenol，NP)和雙

2、酚A(Bisphenol A，BPA)的生物毒性評價迫切需要能夠反映NP和BPA在環(huán)境中的實際毒性效應(yīng)的方法，但是NP和BPA的化學(xué)分析方法費時費力、費用昂貴。因此，研究NP和BPA的生物分析方法成為了生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域的一個熱點，本文研究了NP和BPA對鯽原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的毒性作用和雌激素效應(yīng)。 一、 采用Percoll法建立鯽肝細(xì)胞原代培養(yǎng)模型 建立從非實質(zhì)細(xì)胞和血細(xì)胞中分離得到高純度和活力肝實質(zhì)細(xì)胞的方法是對硬骨魚類肝

3、細(xì)胞研究的前題條件。本實驗用percoll液密度梯度離心的方法分離得到了高純度和活力的肝實質(zhì)細(xì)胞。以Ⅳ型膠原酶消化法分離鯽肝細(xì)胞，然后將其分成2組，1組不再經(jīng)過進一步處理(即對照組)；另1組再用Percoll液密度梯度離心純化肝細(xì)胞(即實驗組)，然后將兩組細(xì)胞接種于DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d。在倒置顯微鏡下觀察兩組肝細(xì)胞的形態(tài)并繪制細(xì)胞生長曲線；采用臺盼藍(lán)染色法比較兩組肝細(xì)胞的存活率；通過H.E染色法在光鏡下檢測肝細(xì)胞的純度；采

4、用MTT比色法測定兩組肝細(xì)胞的增殖率；收集肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測白蛋白、尿素以及乳酸脫氫酶的水平以檢測兩組肝細(xì)胞功能。結(jié)果表明，對照組鯽肝細(xì)胞存活率為80.6％，純度為83.2％；實驗組肝細(xì)胞存活率和純度明顯高于對照組(P<0.05)，分別為94.2％和95.1％。從開始接種到大部分肝細(xì)胞貼壁生長，實驗組比對照組肝細(xì)胞的增殖明顯加快(P<0.05)。白蛋白分泌功能、尿素合成能力及乳酸脫氫酶檢測結(jié)果表明，實驗組培養(yǎng)上清液中白蛋白分泌量、尿素

5、合成能力明顯高于對照組(P<0.05)；而乳酸脫氫酶含量明顯低于對照組(P<0.05)。 二、 壬基酚和雙酚A對鯽原代培養(yǎng)肝細(xì)胞毒性作用 用10<'-4>mol/L、10<'-5>mol/L、10<'-6>mol/L、10<'-7>mol/L、10<'-8>mol/L NP和BPA分別暴露鯽原代培養(yǎng)肝細(xì)胞48h，用MTT法測定NP和BPA對肝細(xì)胞生長抑制影響；測定培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)含量，分析NP和BPA對肝細(xì)

6、胞膜損傷的影響；測定肝細(xì)胞丙二醛(MDA)和谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)的含量，分析NP和BPA對肝細(xì)胞氧化損傷作用；用熒光分光光度計測定肝細(xì)胞EROD的含量，建立NP和BPA對肝細(xì)胞EROD誘導(dǎo)的劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明當(dāng)NP濃度≥10<'-7>mol/L或BPA濃度≥10<'-5>mol/L時肝細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)。當(dāng)NP濃度≥10<'-7>mol/L或BPA濃度≥10<'-6>mol/L時肝細(xì)胞LDH漏出量明顯增加(P<

7、0.05)。當(dāng)NP濃度≥10<'-7>mol/L或BPA濃度≥10<'-6>mol/L時肝細(xì)胞MDA含量明顯增加(P<0.05)。當(dāng)濃度≥10<'-7>mol/L時，NP和BPA均能引起肝細(xì)胞氧化損傷使GST酶含量增加(P<0.05)。當(dāng)NP濃度≥10<'-8>mol/L或BPA濃度≥10<'-7>mol/L時與對照組相比肝細(xì)胞EROD含量明顯增加。NP和BPA對EROD誘導(dǎo)的EC<,50>分別是277nmol/L，1261nmol/L

8、；劑量效益曲線方程為分別為：NP：Y=3.86781n(X)+15.523；R<'2>=0.9721BPA：Y=4.51021n(X)+3.5501；R<'2>=0.9642 由以上結(jié)果可知NP對肝細(xì)胞的毒性作用強于BPA,對EDCs的檢測靈敏度強弱依次為：EROD>GST>MDA，LDH。 三、 壬基酚和雙酚A對鯽原代培養(yǎng)肝細(xì)胞卵黃蛋白原的誘導(dǎo) 卵黃蛋白原(VTG)作為檢測環(huán)境雌激素生物標(biāo)志物的研究已成為生態(tài)毒理學(xué)

9、研究的熱點。在雌激素誘導(dǎo)下，魚類肝臟VTG mRNA表達敏感性高、受外界干擾小，因此，魚肝臟VTG mRNA可以作為一種新的標(biāo)志物而應(yīng)用到環(huán)境雌激素的檢測中去。 本實驗用10<'-7>mol/L、10<'-5>mol/L NP和10<'-6>mol/L、10<'-4>mol/L BPA分別暴露作用鯽原代培養(yǎng)肝細(xì)胞48h，用Trizol法提取肝細(xì)胞總RNA，用自己設(shè)計的引物，通過RT-PCR.的方法檢測肝細(xì)胞VTG mRNA表