基于化學生物學方法結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術的中藥藥效物質(zhì)快速篩選方法研究.pdf

1、中藥藥效物質(zhì)基礎研究是中藥作用機理探討、創(chuàng)新藥物研制和建立與藥效相關的中藥質(zhì)量控制標準的基礎，是中藥現(xiàn)代化研究中的重中之重。而中藥藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)是中藥藥效物質(zhì)基礎研究的核心內(nèi)容，建立中藥藥效物質(zhì)的快速篩選方法對中藥現(xiàn)代化研究具有重要的推動作用。本文聚焦于中藥藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)方法的技術性問題，著重研究基于化學生物學方法結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術的中藥藥效物質(zhì)快速篩選新方法。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴建立HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS方

2、法對養(yǎng)心氏片的化學成分進行了系統(tǒng)性分析，共鑒定了其中127個化合物，對其結(jié)構(gòu)進行了分類和質(zhì)譜裂解規(guī)律的解析。采用DPPH-LC-MS分析技術對養(yǎng)心氏片中的抗氧化物質(zhì)基礎作了進一步的研究，從中快速篩選到34個潛在的抗氧化成分。其中丹酚酸A和丹酚酸B為最強的抗氧化物質(zhì)，其DPPH自由基清除活性高于VC。通過對大鼠口服養(yǎng)心氏片的入血成分進行分析，發(fā)現(xiàn)丹酚酸A和丹酚酸B可以入血，可能是養(yǎng)心氏片發(fā)揮體內(nèi)抗氧化作用的重要藥效物質(zhì)。⑵創(chuàng)新性地提出了一

3、種血腦屏障人造膜平行性透過試驗與DPPH探針識別相結(jié)合的PAMPA-BBB-DPPH方法，并將其應用于中藥中可透過血腦屏障的抗氧化物質(zhì)篩選。發(fā)現(xiàn)知母乙酸乙酯提取物為活性中藥提取物。通過DPPH-HPLC結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術，鑒定出知母提取物中的可透過血腦屏障的抗氧化物質(zhì)為2，6，4'-Trihydroxy-4-methoxybenzophenone。體外研究表明，該物質(zhì)具有中等強度的抗氧化活性，其DPPH自由基清除能力略弱于VC等抗氧化劑

4、，但是其血腦屏障人造膜透過能力很強，具有深入開發(fā)為腦保護藥物的價值。⑶將親和超濾LC-MS方法與分子對接技術相結(jié)合，首次應用于中藥注射劑與人血清白蛋白相互作用的研究。發(fā)現(xiàn)丹紅注射液中的丹酚酸類成分有很強的人血清白蛋白結(jié)合作用，且與聯(lián)用藥阿司匹林的主要代謝產(chǎn)物水楊酸存在競爭作用。通過競爭性結(jié)合試驗、分子對接、結(jié)合位點探針替代試驗等方法解釋了其競爭機制。研究內(nèi)容為丹紅注射液與人血清白蛋白的相互作用研究奠定了基礎，同時也為中藥注射劑與人血清白

5、蛋白的相互作用研究提供了新的思路。⑷提出一種基于固定化融合靶點親和色譜的親和選擇方法，將其應用于PPARγ配體的篩選。通過基因工程技術將靶點受體與親和標簽融合，可以實現(xiàn)靶點蛋白的快速制備、定向固定及純化，從而應用于天然產(chǎn)物中相應配體的篩選。相比于之前報道的親和選擇篩選方法，可低成本地獲得大量靶點蛋白，實現(xiàn)快速、定向的靶點固定，并能提高篩選通量。應用該方法發(fā)現(xiàn)野菊花中的異綠原酸A具有較強的PPARγ結(jié)合能力。該研究為親和選擇方法的建立提供