基于合成生物學的地雷檢測方法研究.pdf

1、地雷是一種常見的隱蔽性極高的防御性爆炸火器。早在公元1130年就有地雷使用的相關記錄。19世紀中葉以后，烈性炸藥2，4，6-三硝基甲苯的發(fā)現(xiàn)，推動了地雷制式化、多樣化的發(fā)展，地雷作為一種廉價、高效的防御武器一直沿用至今。
　　地雷的應用對現(xiàn)代戰(zhàn)爭產(chǎn)生了巨大的推動作用，地雷以其高隱蔽性和高殺傷性的優(yōu)勢，使其幾乎受到了歷次現(xiàn)代戰(zhàn)爭的青睞，因此如何在戰(zhàn)場上安全、有效地偵測出地雷埋藏位置，是所有交戰(zhàn)雙方必須解決的問題。此外，地雷對有生力量

2、的殺傷作用并不僅僅在戰(zhàn)爭過程中，地雷的長效性和殺傷性并不隨戰(zhàn)爭的結束而終結，許多地雷在戰(zhàn)場上并未引爆或排除，這些遺留地雷至今仍在威脅著當?shù)厝嗣竦纳踩?。因此針對地雷安全、有效的偵測方法一直是各國軍事武器專家廣為研究的課題。
　　傳統(tǒng)的地雷檢測方法有生物探測、金屬探測、聲波探測、雷達探測等，這些傳統(tǒng)的探測手段有一定的局限性。生物探測主要基于動物對于氣味的感官反應，由于動物思想不可控制，探測具有很大的不確定性;金屬、聲波和雷達探測主

3、要基于探測者的主觀判斷，并且大多數(shù)情況下需要身赴雷區(qū)，具有很大的危險性，并且無法針對目前出現(xiàn)的陶瓷、塑料等新型材質的地雷進行探測。為了解決以上這些問題，基于合成生物學的地雷檢測方法應運而生。該方法可依據(jù)地雷的爆炸填充物為靶標化合物進行檢測，規(guī)避了地雷材質的問題。利用細菌進行群體檢測可以有效地避免個體主觀差異對探雷的影響，提高地雷檢測的客觀準確性，可以與傳統(tǒng)的地雷檢測方法互為補充，進而提高地雷檢測的準確性和安全性。
　　合成生物學是

4、20世紀發(fā)展起來的一門基于生命科學的多學科交叉新興學科。目前合成生物學的研究內容主要可以分為以下三個層次:一是對自然界已知功能的生物元件進行標準化設計，進而形成模塊，根據(jù)工程學思想，自下而上進行逐級組裝，構建出具有全新功能的基因線路或生命系統(tǒng);二是隨著基因合成技術的發(fā)展，通過人工設計、合成、組裝新的生命體基因組，實現(xiàn)生命體的重構;第三個層次建立在前兩個層次的基礎上，創(chuàng)造完整的全新生物系統(tǒng)，乃至人工生命體。
　　生物傳感器的構建系基

5、于合成生物學研究內容的第一層次，通過挖掘自然界中對靶標化合物敏感的感應元件與適于體現(xiàn)感應強度的報告元件進行組裝，通過對報告元件所產(chǎn)生信號的讀取分析，感應出靶標化合物的濃度、位置等信息。
　　本研究擬構建的地雷探測生物傳感器也主要由感應元件和報告元件構成，目前生物傳感器報告元件的發(fā)展已經(jīng)比較成熟，主要有l(wèi)uxCDABE、GFP、lacZ等。研究主要以地雷的常規(guī)爆炸裝填物2，4，6-Trinitrotoluene(TNT)為靶標分子，

6、挖掘自然界存在的感應元件，并對其進行一系列分析和改造以提高感應活性，或通過自然界中已有報道的一些可感應TNT的調控線路，構建基因傳感線路，最后圍繞合成生物學生物傳感器的構建，搭建可用于細菌自裂解的基因模塊，以期實現(xiàn)完整生物傳感器的構建。
　　研究內容主要分為以下幾個方面:
　　(1)天然TNT感應元件發(fā)掘
　　選擇實驗室遺傳操作最為明晰的大腸桿菌入手，進行大腸桿菌的TNT天然感應元件挖掘。為了便于啟動子文庫的構建與篩選

7、，首先構建了一個可用于啟動子篩選的載體pTJH629，向載體中引入了大腸桿菌低拷貝復制子pSC101 ori。
　　通過提取純化E.coli K-12 MG1655基因組，并利用SA U3AI內切酶對其完全酶切，以luxCDABE化學發(fā)光為報告手段構建大腸桿菌基因組天然啟動子文庫，經(jīng)過高低濃度TNT的兩輪篩選，在文庫中得到具有一定特異性和靈敏度的5個啟動元件，并對5個啟動元件進行特異性、靈敏度、時效性分析，發(fā)現(xiàn)其具有較好的啟動活性

8、。
　　通過對5個元件基因序列的進一步分析，在大腸桿菌基因組中比對得到相應位置序列信息，通過數(shù)據(jù)庫比對以及啟動子在線預測等方法，得到了各個元件序列中可能存在的啟動序列。接著利用體外直接退火擴增的方法，得到這些序列，并針對啟動元件對TNT的敏感性進行研究，以對元件的最小功能序列進行確證，最后確證了其中兩個元件發(fā)揮功能的最小序列topAp4和recEA4。
　　(2)基于應激損傷機制的人工啟動子文庫構建與篩選
　　通過上一

9、步中對大腸桿菌基因組中啟動元件的篩選發(fā)現(xiàn)，topA和recEA4均屬于細菌SOS家族成員，同時結合文獻調研，發(fā)現(xiàn)細菌應急損傷家族可以受到TNT的誘導反應。因此進一步對SOS家族的基因啟動子進行了考察，從中得到了幾個對TNT有明顯誘導反應的啟動子。通過對篩選得到的SOS啟動元件進行序列分析，從其中序列共性較多的啟動子(sulA、recA、umuDC)著手，對其序列的保守區(qū)進行提取，對其可變區(qū)進行完全隨機突變，構建SOS啟動子的隨機突變文庫

10、。在文庫中對TNT感應情況進行考察，從中篩選出了5個可受TNT調控的全新的SOS啟動子，通過對啟動特性的考察，發(fā)現(xiàn)其在保證特異性、時效性等特性的基礎上其靈敏度較野生型SOS啟動子都有顯著提升。
　　(3)惡臭假單胞菌XylR5-Pu-GFP測線路構建
　　惡臭假單胞菌mt-2能夠以甲苯硝基衍生化合物中的硝基作為氮源進行生理代謝，因此惡臭假單胞菌中肯定存在可受TNT誘導的調控元件，根據(jù)文獻調研發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮功能的關鍵元件為TOL質

11、粒上的XylR-Pu線路。XylR蛋白作為惡臭假單胞菌甲苯代謝通路中的關鍵調控因子，可受甲苯及其衍生化合物的調控反應，激活上游的Pu啟動子，根據(jù)此調控原理，以文獻報道的對2,4-Dinitrotoluene（2，4-DNT）特異的XylR突變體XylR5為調控因子，以GFP為報告基因，構建了XylR-Pu-GFP基因調控線路。利用重組工程方法將線路整合到假單胞菌基因組上，并通過Cre-loxP實現(xiàn)了構建過程中抗性基因的敲除，實現(xiàn)了生物傳

12、感器基因工程菌的菌株構建。同時搭建了一個質粒平臺pSN129，可通過對平臺上的元件進行替換，實現(xiàn)線路功能的轉換。
　　(4)可受阿拉伯糖誘導的細菌自裂解模塊構建
　　為了實現(xiàn)基因工程菌對環(huán)境的無污染、無殘留，本研究還開展了對生物傳感器的檢測后自毀模式的研究。通過文獻調研發(fā)現(xiàn)了T4噬菌體的穿孔素蛋白Holin與T4溶菌酶的配合使用可調控實現(xiàn)細菌自殺，以此為基礎設計構建了pBAD-Holin-Lysozyme-AntiHolin

13、的自殺線路，通過引入Holin拮抗蛋白AntiHolin的表達，實現(xiàn)了含有自殺表達模塊的菌株的正常生長，同時通過替換AntiHolin的啟動子，實現(xiàn)其不同強度的表達，也可使自殺的起效時間、自殺強度高低得到一定控制。
　　綜上所述，在本研究中以大腸桿菌基因組為模板，構建了基因組天然啟動子文庫，從中篩選得到了5個可受TNT誘導的天然啟動子元件，其啟動活性均達到或超過了國際上報道的元件的領先水平;結合篩選結果與文獻調研，通過對大腸桿菌S

14、OS應激損傷系統(tǒng)的啟動子篩查，得到了幾個可受TNT調控的SOS啟動子，通過對其進行序列分析，設計了一個SOS啟動子的隨機突變文庫，并在文庫中篩選得到了5個全新的SOS啟動元件，并且其靈敏度較同類元件有顯著提高;通過對假單胞菌天然元件XylR-Pu的應用，構建了XylR5-Pu-GFP基因工程菌，并實現(xiàn)了基因組引入抗性的剔除，并且構建了一個基因線路平臺pSN129，可便捷的替換元件改變功能;通過對T4噬菌體Holin蛋白與穿孔素蛋白作用原