蔬菜有機(jī)磷農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)儀的研制.pdf

1、殺蟲(chóng)劑對(duì)于農(nóng)業(yè)的增產(chǎn)保收具有非常重要的作用。隨著有機(jī)氯農(nóng)藥的全面禁用，有機(jī)磷農(nóng)藥因其低殘留、易水解的特性而被廣泛使用，現(xiàn)在登記注冊(cè)的有機(jī)磷農(nóng)藥已經(jīng)有100多種。有機(jī)磷農(nóng)藥在食物中特別是在蔬菜中的殘留對(duì)人類(lèi)身體健康的潛在危害引起了人們的廣泛關(guān)注。目前測(cè)量農(nóng)藥殘留主要采用色譜法，其中氣相色譜法是有機(jī)磷農(nóng)藥最通用的方法，該法雖然準(zhǔn)確可靠，但耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中，仍需要快速、靈敏、選擇性高、實(shí)用的檢測(cè)設(shè)備。酶?jìng)鞲衅髟?/p>

2、此方面具有較好的開(kāi)發(fā)優(yōu)勢(shì)。 生態(tài)毒理學(xué)的研究表明，有機(jī)磷農(nóng)藥的毒性作用主要?dú)w因于對(duì)動(dòng)物乙酰膽堿酯酶(AChE)的抑制，而且在一定的濃度范圍內(nèi)，有機(jī)磷農(nóng)藥與AChE的活性之間存在良好的劑量—效應(yīng)關(guān)系。這是基于AChE的酶?jìng)鞲衅鞅O(jiān)測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的理論基礎(chǔ)。 不同生物來(lái)源的AChE對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥具有不同的敏感性。因此，為了制備靈敏檢測(cè)蔬菜中微量有機(jī)磷農(nóng)藥的酶?jìng)鞲衅?，首先需要篩選出對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥能夠產(chǎn)生敏感響應(yīng)的動(dòng)物AChE。本研究比較

3、了三種不同來(lái)源(電鰻電器官、鲅魚(yú)腦、家蠅)的AChE對(duì)四種有機(jī)磷農(nóng)藥(馬拉硫磷、甲基對(duì)硫磷、辛硫磷、毒死蜱)的敏感性，發(fā)現(xiàn)，對(duì)于馬拉硫磷和甲基對(duì)硫磷而言，AChE敏感性順序?yàn)椋弘婗犽娖鞴伲决阳~(yú)腦＞家蠅；而對(duì)于毒死蜱和辛硫磷而言，AChE敏感性順序則為：家蠅＞電鰻電器官＞鲅魚(yú)腦。綜合考慮酶對(duì)四種農(nóng)藥的敏感性，來(lái)自電鰻電器官的AChE是較為理想的指示有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感酶，適于作為制作酶?jìng)鞲衅髯R(shí)別元件的生物材料。 酶的固定化是制作酶?jìng)鞲?/p>

4、器的核心技術(shù)。固定化酶的質(zhì)量好壞直接影響到酶?jìng)鞲衅鞯姆€(wěn)定性、靈敏度和選擇性及其應(yīng)用價(jià)值。本研究采用兩種方法對(duì)電鰻電器官的AChE進(jìn)行固定：一種是以凝膠為載體的共價(jià)鍵合法；另一種是以氨基化的可控孔度的硅珠(CPG)為載體的戊二醛交聯(lián)法。以酶活性回收率和保存時(shí)間等指標(biāo)對(duì)固定效果進(jìn)行比較，然后在流動(dòng)注射系統(tǒng)中通過(guò)測(cè)定酶促反應(yīng)的產(chǎn)生的電位峰值對(duì)兩種固定化酶的穩(wěn)定性和工作壽命進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)同等活力的溶液酶進(jìn)行固定，戊二醛交聯(lián)法所得到的固定

5、化酶的活力回收率比共價(jià)鍵合法低10％左右，兩者的有效保存期也相差不大，但是就酶活力穩(wěn)定性和工作壽命而言，硅珠交聯(lián)法所得到的固定化酶則明顯優(yōu)于凝膠共價(jià)鍵合法所制備的固定化酶，這種方法制備的固定化酶可連續(xù)使用28次而沒(méi)有明顯的活性損失，電位峰值的重現(xiàn)性較好。因此認(rèn)為，以硅珠為載體的戊二醛交聯(lián)法是制備固定化AChE的理想方法。 有機(jī)磷農(nóng)藥與固定化酶之間的劑量—效應(yīng)關(guān)系是酶?jìng)鞲衅鳒?zhǔn)確定量樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥的重要依據(jù)。以戊二醛交聯(lián)法制備的固

6、定化AChE為識(shí)別元件，以pH復(fù)合電極為換能器，組成流動(dòng)注射型酶?jìng)鞲衅鳌Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)，該傳感器的最佳工作條件如下：固定時(shí)加入的酶量為20u，底物濃度為20g/L，載液為1mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，流速為0.45mL/min，抑制時(shí)間為10min，溫度為30℃。在此條件下，測(cè)定了固定化AChE的酶活抑制率隨對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥處理濃度的變化，得到四種有機(jī)磷農(nóng)藥與固定化酶活力之間的濃度—抑制率關(guān)系曲線(xiàn)。期間，采用NaClO對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行預(yù)氧化，以

7、提高酶?jìng)鞲衅鲗?duì)目標(biāo)農(nóng)藥的敏感響應(yīng)程度；采用2-PAM恢復(fù)受到抑制的固定化AChE的活力，以保證酶?jìng)鞲衅髂軌蜻B續(xù)多次使用。 為減輕樣品測(cè)定過(guò)程中的人工操作力度，將上述酶?jìng)鞲衅髋c計(jì)算機(jī)相結(jié)合，通過(guò)軟件實(shí)現(xiàn)樣品測(cè)定的程序化作業(yè)，主要包括樣品樣品的預(yù)氧化、穩(wěn)定基線(xiàn)、基礎(chǔ)酶活峰值測(cè)定、抑制酶活峰值測(cè)定、計(jì)算與顯示五個(gè)步驟，樣品測(cè)定時(shí)間約為30min。酶?jìng)鞲衅鲗?duì)磷酸鹽緩沖溶液中四種農(nóng)藥的檢出限分別為：毒死蜱9.5μg/L、馬拉硫磷10.4μ

8、g/L，甲基對(duì)硫磷14.3μg/L，而辛硫磷28.5μg/L?？梢?jiàn)，在提取比為1的情況下，儀器對(duì)蔬菜樣品中這些農(nóng)藥的檢測(cè)靈敏性可以滿(mǎn)足國(guó)家農(nóng)藥殘留量控制標(biāo)準(zhǔn)的要求。以目標(biāo)農(nóng)藥含量為100μg/kg的油菜為測(cè)定對(duì)象，采用含1％甲醇的磷酸鹽緩沖溶液為提取劑，在提取比為1的情況下，傳感器對(duì)四種農(nóng)藥檢測(cè)值的相對(duì)誤差分別為：馬拉硫磷-11.4％、毒死蜱+22.5％、甲基對(duì)硫磷-30.0％、辛硫磷+86.1％?？梢?jiàn)本研究開(kāi)發(fā)的檢測(cè)儀對(duì)蔬菜中的前三種