2,3-吲哚醌抑制人神經(jīng)母瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：神經(jīng)母細(xì)胞瘤是小兒最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，惡性程度高，早期即發(fā)生轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移是神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒最主要的死亡原因。2，3-吲哚醌(2，3-dioxoindoline，ISA，Isatin)是存在于哺乳動(dòng)物體液及組織中的一種天然物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，是我國(guó)I類抗癌新藥靛玉紅的單體結(jié)構(gòu)，已發(fā)現(xiàn)Isatin可以抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并初步發(fā)現(xiàn)其有抑制侵襲轉(zhuǎn)移的作用，因此本研究擬進(jìn)一步明確Isatin對(duì)神

2、經(jīng)母細(xì)胞瘤侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討，為Isatin的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為最終將該藥開(kāi)發(fā)成一種新型的具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的天然抗癌藥物奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法：體外培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，采用不同濃度（10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、800μmol/L）的Isatin作用于體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，并計(jì)算其IC50值；采用劃痕實(shí)

3、驗(yàn)檢測(cè)不同濃度Isatin（0、50、100、200μmol/L）作用后SH-SY5Y細(xì)胞的遷移能力；采用transwell小室檢測(cè)不同濃度Isatin（0、50、100、200μmol/L）作用后SH-SY5Y細(xì)胞侵襲和運(yùn)動(dòng)能力；使用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)Isatin對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞基因表達(dá)的影響，并篩選出與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的通路及基因，并采用RT-PCR驗(yàn)證其相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)；采用Western blotting檢測(cè)與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)

4、蛋白磷酸化水平或表達(dá)水平的變化。
　　研究結(jié)果：Isatin對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞作用的IC50值為279.7μmol/L，CCK-8結(jié)果顯示Isatin能抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖且呈濃度依賴性，隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的皺縮、且細(xì)胞數(shù)目明顯減少；與對(duì)照組相比，Isatin處理組細(xì)胞的遷移能力明顯減弱（P＜0.05），并且具有濃度依賴性；與對(duì)照組相比，細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)能力顯著下降（P＜0.01），且呈濃度依賴性；基因表達(dá)譜芯片

5、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Isatin作用后，共有284個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，145個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，芯片提示mTOR信號(hào)通路可能是Isatin的效應(yīng)靶點(diǎn)，其中DDIT4、RHEB、EIF4EBP1、RPS6KB1為mTOR信號(hào)通路的相關(guān)基因；RT-PCR結(jié)果與基因表達(dá)譜芯片預(yù)測(cè)的結(jié)果相一致，DDIT4和EIF4EBP1基因表達(dá)上調(diào)，RHEB和RPS6KB1基因表達(dá)下調(diào)；Western blotting檢測(cè)與mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示AMPK的磷

6、酸化水平顯著上調(diào)(P＜0.01)，且呈濃度依賴性；mTOR的磷酸化水平下調(diào)(P＜0.01)，呈濃度依賴性；HIF-1α和VEGF的蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)(P＜0.01)，呈濃度依賴性；PI3K和Akt的磷酸化水平隨藥物濃度的增加而無(wú)明顯變化。
　　研究結(jié)論：Isatin對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的增殖和侵襲遷移具有抑制作用；基因表達(dá)譜芯片結(jié)果提示Isatin抑制SH-SY5Y細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用可能是多靶點(diǎn)的，對(duì)mTOR通路相關(guān)蛋白的影響是I