新型的以組蛋白h139;0為骨架的靶向于egf受體的基因導入系統(tǒng)的構建

1、復旦大學博士學位論文新型的以組蛋白H1為骨架的靶向于EGF受體的基因導入系統(tǒng)的構建姓名：戴菲寒申請學位級別：博士專業(yè)：病原生物學指導教師：顧健人20020428新型的咀組蛋白H 1 0 為骨架的靶向于E G F 受體的基因導入系統(tǒng)的構建 中文摘要融合蛋白的表達宿主菌是H M S l 7 4 ( D E 3 ) ，表達產(chǎn)物通過S PS e p h a r o s e 和S e p h a d e xG 一5 0 純化。所有的融合蛋白與質粒

2、D N A 混合后，都能阻滯D N A 在1 ％瓊脂糖凝膠中的遷移，電泳結果表明融合蛋白具有結合D N A 的能力。D N A 與蛋白結合的最佳質量比為1 ：3 。我們采用了經(jīng)免疫組化鑒定表達E G F 受體的S K O V 3 裸鼠皮下移植瘤、B E L 一7 4 0 2 細胞株、B E L 一7 4 0 2 裸鼠皮下移植瘤作為靶細胞、組織以檢測融合蛋白的生物學活性。U 2 0 S 細胞表面未檢測出E G F 受體的表達，作為導入實驗

3、的陰性對照。體外導入實驗表明，只有2 種蛋白組合( G E 7 一h i s t o n e —H A 2 0 ／H i s t o n e ．G E 7 ，H i s t o n e - G E 7 ／H i s t o n e ．H A 2 0 ) 能將D —g a l 基因導入表達E G F 受體的細胞，其他組合或單獨的蛋白均不能將D N A 靶向性地導入E G F 受體高表達的細胞。體內導入實驗表明，未連接G E 7 或H A

4、2 0的組蛋白不能將D N A 靶向性地導入細胞，單獨H i s t o n e —H A 2 0 也是同樣的結果：單獨的H i s t o n e —G E 7 ，G E 7 - h i s t o n e —H A 2 0 ，H A 2 0 一h i s t o n e —G E 7 組的腫瘤中僅檢測出少量6 ．g a l基因的表達；將H i s t o n e ．G E 7 和H i s t o n e ．H A 2 0 等量混合

5、后，p —g a l 基因的表達有所增加：G E 7 ．h i s t o n e ．H A 2 0 和H i s t o n e ．G E 7 等量混合后，S K O V 3 和B E L 一7 4 0 2 腫瘤中可檢測到大量p —g a l 基因的表達。體外導入篩選實驗表明，H i s t o n e 盯．1 9 3 為骨架的基因導入系統(tǒng)活性不如H i s t o n e 全長。G E 7 - h i s t o n e —H A

6、2 0 ／H i s t o n e ．G E 7 蛋白組合是經(jīng)體內外導入實驗篩選獲得的最佳基因導入系統(tǒng)。我們同時研究了G E 7 - h i s t o n e ．H A 2 0 ／H i s t o n e 。G E 7 蛋白組合介導的D —g a l 基因在腫瘤組織中的表達隨時間推移的變化：在皮下瘤周注射后1 2 小時，就有p ．g a l 基因的表達，2 4 小時表達達到高峰，4 8 小時開始下降，9 6 小時、7 天、1 0

7、天表達繼續(xù)下降，2 周后腫瘤組織內仍有少量p ．g a l 基因表達。腫瘤組織中導入的p ．g a l 基因的表達水平還隨復合體劑量的增加而上升。含D N A 1 9 9 的復合體是皮下瘤周注射的最佳劑量。這一設計思路將基因導入系統(tǒng)中各種功能成分連接后通過基因工程方法表達，屬首次嘗試與報道，因此僅僅是一個起點。由于給藥后，復合體顆粒要歷經(jīng)細胞內外的重重障礙，才能到達靶細胞核，在整個過程中，有眾多干擾因素阻礙著復合體的導入進程，增加復合體