靶向細(xì)胞dsRNA的重組蛋白dsCARE介導(dǎo)的抗病毒作用.pdf

1、病毒感染會導(dǎo)致多種疾病,長期的病毒感染甚至?xí)T發(fā)細(xì)胞癌變;目前常見的抗病毒藥物機(jī)理主要是干擾病毒DNA、RNA復(fù)制或蛋白合成,但是這些藥物對正常細(xì)胞具有一定毒性,并且病毒的免疫逃逸使藥物對病毒的抑制效果降低,因此療效不是十分理想。dsRNA是病毒感染過程中的普遍特征,目前除了-ssRNA病毒外,幾乎所有病毒感染時在細(xì)胞質(zhì)中都能檢測到長鏈dsRNA的存在。因此,研究是否能以dsRNA作為抗病毒藥物的靶標(biāo),對于尋找新的廣譜抗病毒靶點(diǎn)具有十分

2、重要的意義。
　　細(xì)胞在受到外源微生物感染時,通常通過清除受感染的細(xì)胞而抑制病毒的增殖。在這個過程中,細(xì)胞主要通過TLRs和RLRs家族成員識別病毒dsRNA。這些家族蛋白具有一些類似的結(jié)構(gòu),包括dsRNA結(jié)合區(qū)和CARD結(jié)構(gòu)域,其效應(yīng)是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這一理論基礎(chǔ)為我們設(shè)計抗病毒藥物提供了新的思路,我們課題組前期仿照RLRs的結(jié)構(gòu)設(shè)計了一種包含dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和凋亡誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的融合蛋白,命名為dsCARE;dsCARE理論上應(yīng)

3、該能識別dsRNA并發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
　　本課題運(yùn)用分子生物學(xué)的基本實驗技術(shù),包括重組表達(dá)載體構(gòu)建、蛋白表達(dá)純化、westernblot、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、透射電鏡技術(shù)以及動物模型建立和病例組織染色等,表達(dá)純化了重組蛋白dsCARE并構(gòu)建、表達(dá)和純化其截短體,通過不同類型病毒感染細(xì)胞模型(ADV、RSV)在細(xì)胞水平上驗證了dsCARE對病毒感染的防治作用,并揭示了其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)理,通過VACV在動物體內(nèi)驗證了dsC

4、ARE的保護(hù)作用;dsCARE的有效作用不僅提供了基于dsRNA的抗病毒候選新藥研究基礎(chǔ),而且為研究長鏈dsRNA提供了一種有力工具,為進(jìn)一步的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)。
　　第一部分:dsCARE及其截短體的原核表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)及純化
　　我們采用原核表達(dá)載體pRSET和工程菌E.coliBL21(DE3)表達(dá)dsCARE、dsCAREΔRBD和dsCAREΔCARD,用Ni-NTA親和純化表達(dá)的蛋白并柱上復(fù)性,最后超濾

5、濃縮。dsCARE在37oC主要以包涵體形式表達(dá),其截短體在37oC在胞質(zhì)中可溶性表達(dá);實驗室條件下每升培養(yǎng)基可收獲濕菌體約10g,每10g濕菌體可純化重組dsCARE約7.5mg,濃度約200-300μg/ml,SDS-PAGE純度達(dá)到95.8％;dsCAREΔRBD濃度約為150μg/ml,dsCAREΔCARD濃度約為330μg/ml。
　　第二部分:dsCARE的抗病毒作用及其機(jī)理研究
　　我們選用ADV感染HEK2

6、93細(xì)胞作為DNA病毒感染模型,RSV感染HEp-2細(xì)胞作為負(fù)鏈RNA病毒感染模型,分別用來進(jìn)行dsCARE保護(hù)作用的研究;之后又分別用免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,用電鏡的方法觀察細(xì)胞死亡的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。結(jié)果證明dsCARE對DNA病毒和負(fù)鏈RNA感染都有防御作用;dsCARE誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡包括凋亡的途徑,還具有程序性壞死的特征。
　　第三部分:dsCARE在動物體內(nèi)抗病毒作用研究
　　我們選用VACV感染Balb/c小