酶轉(zhuǎn)化異丁香酚制備香草醛的反應(yīng)分離耦合方法

1、第5卷第3期過(guò)程工程學(xué)報(bào)Vol.5No.32005年6月TheChineseJournalofProcessEngineeringJune2005收稿日期：2004?08?11，修回日期：2004?09?21基金項(xiàng)目：國(guó)家973規(guī)劃基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：2003CB716008)作者簡(jiǎn)介：王豐收(1977?)，男，山東省濰坊市人，碩士研究生，生物催化與生物轉(zhuǎn)化專業(yè)；孫志浩，通訊聯(lián)系人，Tel:05105808498，Email:sunw@

2、public1.wx..酶轉(zhuǎn)化異丁香酚制備香草醛的反應(yīng)分離耦合方法王豐收，趙麗青，孫志浩(江南大學(xué)生物催化研究室，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214036)摘要：大豆脂氧合酶粗酶轉(zhuǎn)化異丁香酚制備香草醛的過(guò)程中存在產(chǎn)物抑制酶轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，吸附劑HD?8樹(shù)脂可以有效解除產(chǎn)物抑制，提高轉(zhuǎn)化率.確定了加入底物量1.5%(?)、樹(shù)脂量150gL的優(yōu)化轉(zhuǎn)化工藝，使反應(yīng)與分離進(jìn)行很好的耦合，既提高了轉(zhuǎn)化率，又能較好地實(shí)現(xiàn)底物和產(chǎn)物的分離.在優(yōu)化

3、條件下香草醛最高轉(zhuǎn)化量可達(dá)3.41gL，相應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率為24.53%.樹(shù)脂洗脫法提取的產(chǎn)物得率為67.11%，底物的回收率為71.88%.關(guān)鍵詞：酶法轉(zhuǎn)化；香草醛；異丁香酚；反應(yīng)分離耦合中圖分類號(hào)：Q814.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1009?606X(2005)03?0273?041前言香草醛，又名香蘭素(Vanillin)，是香莢蘭制品中的重要組成部分，作為一種廣譜型高檔香料，廣泛應(yīng)用于食品、煙草及醫(yī)藥工業(yè)，需求量很大.香草醛目前

4、主要由化學(xué)方法制備，但用化學(xué)合成法制得的香草醛不是天然香料.天然香草醛可以從香莢蘭的花莢中提取，但這樣得到的香草醛量少而價(jià)高，不能滿足日益增長(zhǎng)的需求.用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)生物香草醛的研究已經(jīng)有一些成功的實(shí)例[1?6]，研究了各種微生物、植物細(xì)胞內(nèi)合成和降解香草醛的代謝途徑，并在細(xì)胞、酶學(xué)、基因水平上進(jìn)行了廣泛的研究，取得了很多研究成果.其中法國(guó)LesageMeessen等[1]利用阿魏酸作為底物的二步法(先用黑曲霉將阿魏酸轉(zhuǎn)化為香草酸，再用

5、朱紅密孔菌將香草酸轉(zhuǎn)化為香草醛)工藝路線已經(jīng)有稱為“生物香蘭素”的產(chǎn)品上市.筆者課題組也在這方面取得了成功[78].近幾年來(lái)還有一些用丁香酚或異丁香酚進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化或酶轉(zhuǎn)化的研究[9?11].天然來(lái)源的丁香酚或異丁香酚從丁子香油中提取，其價(jià)格比天然提取的阿魏酸便宜得多，用其作為生物轉(zhuǎn)化底物生產(chǎn)香草醛是又一種有應(yīng)用前景的技術(shù)路線.本課題組進(jìn)行了酶法轉(zhuǎn)化異丁香酚制備香草醛的研究[9].前期研究表明，在酶反應(yīng)體系中存在產(chǎn)物抑制的現(xiàn)象，加入合適

6、的樹(shù)脂以吸附產(chǎn)物香草醛進(jìn)行耦合轉(zhuǎn)化，從而可以降低產(chǎn)物抑制，推動(dòng)反應(yīng)正向進(jìn)行，同時(shí)又能實(shí)現(xiàn)底物和產(chǎn)物的有效分離.本研究考察了添加樹(shù)脂對(duì)酶轉(zhuǎn)化異丁香酚制備香草醛的影響.2材料與方法2.1試劑與原料脫脂大豆粉用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心99?6#大豆磨粉，石油醚脫脂后于冰箱中儲(chǔ)藏備用.標(biāo)準(zhǔn)品香草醛、異丁香酚和亞油酸購(gòu)于Sigma公司，異丁香酚原料購(gòu)于北京北大正元科技公司.吸附樹(shù)脂HZ801HZ802HPD600由上海華東理工大學(xué)華震科技開(kāi)發(fā)

7、公司提供.大孔陽(yáng)離子樹(shù)脂D031由杭州爭(zhēng)光樹(shù)脂有限公司提供，大孔陽(yáng)離子樹(shù)脂HD?2和HD?8、離子樹(shù)脂732HZ004JK110及大孔陰離子樹(shù)脂D311D202D293均由上海華東理工大學(xué)華震科技開(kāi)發(fā)公司提供.其他材料均為市售，甲醇為色譜純，其他試劑為分析純.2.2大豆脂氧合酶粗酶液的制備按文獻(xiàn)[9]的方法制備酶液.2.3轉(zhuǎn)化、洗脫和分析方法2.3.1轉(zhuǎn)化方法用制備的pH8.0的酶液作為酶源，250mL三角瓶裝液量20mL，加入20gL

8、底物異丁香酚，再加入樹(shù)脂，于28℃在180rmin搖瓶機(jī)上振蕩轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化結(jié)束后測(cè)定轉(zhuǎn)化液中底物和產(chǎn)物量.2.3.2洗脫方法反應(yīng)后濾去反應(yīng)液，將吸附的樹(shù)脂先用正己烷洗脫異丁香酚，于28℃以180rmin洗脫12h，濾紙過(guò)濾，正己烷洗脫后的樹(shù)脂再用無(wú)水乙醇在同一條件下洗脫香草醛，測(cè)定反應(yīng)濾液、正己烷洗脫液和乙醇洗脫液中的香草醛和異丁香酚含量.2.3.3洗脫產(chǎn)物得率和底物回收率的計(jì)算香草醛提取得率=乙醇洗脫相中的香草醛量100%香草醛總量(濾

9、液正己烷相乙醇相香草醛量)第3期王豐收等：酶轉(zhuǎn)化異丁香酚制備香草醛的反應(yīng)分離耦合方法275速率為5.19310?3mmol(L?min)，是對(duì)照[未加樹(shù)脂，1.82710?3mmol(L?min)]的2.84倍.表明耦合工藝可以大幅度提高轉(zhuǎn)化效率.3.3香草醛的提取和異丁香酚的回收利用3.3.1底物與產(chǎn)物的分離為了從樹(shù)脂上得到產(chǎn)物以及回收未轉(zhuǎn)化的底物，參考有關(guān)文獻(xiàn)[10]，分別對(duì)底物異丁香酚、產(chǎn)物香草醛的萃取溶劑進(jìn)行篩選，以分離并回收底

10、物、提取產(chǎn)物.實(shí)驗(yàn)了多種溶劑，發(fā)現(xiàn)對(duì)香草醛的萃取能力大小依次是：乙醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、正丁醇、叔戊醇、苯、環(huán)乙烷、正己烷，其中乙酸乙酯、乙醇和氯仿的萃取能力相當(dāng)，在pH6.0的條件下2倍體積萃取異丁香酚和香草醛的混合液時(shí)，香草醛一次萃取回收率達(dá)到90%.另外發(fā)現(xiàn)正己烷基本上不能萃取香草醛，但在pH9.0的條件下對(duì)異丁香酚的萃取能力很好.因此，可以采取分步洗脫的方法來(lái)分離HD?8樹(shù)脂上吸附的異丁香酚和香草醛.研究了用正己烷洗脫異丁香

11、酚，再用乙醇洗脫香草醛的分離提取方法.反應(yīng)后過(guò)濾，樹(shù)脂放回原三角瓶，分別用不同體積的正己烷，在180rmin及28℃的條件下洗脫12h，測(cè)定洗脫液中異丁香酚含量，結(jié)果見(jiàn)圖2.由圖可以看出，當(dāng)吸附后樹(shù)脂與正己烷的質(zhì)量體積比為3:40時(shí)，洗脫底物量即達(dá)到最大值(327mg)，再增大正己烷的量洗脫的底物不再增加.反應(yīng)后過(guò)濾，用正己烷洗脫底物異丁香酚后，樹(shù)脂放回原三角瓶，分別用不同體積的無(wú)水乙醇在180rmin及28℃的條件下洗脫12h，測(cè)定洗

12、脫液中香草醛含量，結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖可知，當(dāng)吸附后的樹(shù)脂質(zhì)量與乙醇的體積比超過(guò)3:40時(shí)，洗脫的產(chǎn)物量基本不再變化，達(dá)到50mg.綜上所述，采用分離耦合工藝，反應(yīng)72h后，用40mL正己烷洗脫樹(shù)脂，再用40mL無(wú)水乙醇洗脫樹(shù)脂，各洗脫相濃度見(jiàn)表5.由表可見(jiàn)，有10%～15%左右的香草醛存在于正己烷洗脫相中，部分產(chǎn)物可以隨底物一起進(jìn)入下一次轉(zhuǎn)化.乙醇洗脫相中10%的底物在香草醛的結(jié)晶過(guò)程中被除去，這部分底物無(wú)法回收.從表中數(shù)據(jù)可知，樹(shù)脂吸附

13、法可以使底物和產(chǎn)物有效分離.圖2正己烷加入量對(duì)異丁香酚洗脫的影響圖3乙醇體積對(duì)香草醛洗脫的影響Fig.2EffectsofnhexanevolumeonelutingisoeugenolFig.3Effectofethanolvolumeonelutingvanillin表5產(chǎn)物和底物的分離結(jié)果Table5TheresultsofseparationbetweenproductsubstrateTotalconcentrationofr

14、eactionsolution(gL)Ptioninnhexane(%)Ratioinethanol(%)Yieldrecovery(%)Vanillin3.0713.1067.1167.11Isoeugenol10.7971.8810.5571.88Note:Enzymewith150gLresin15gLsubstrate.3.3.2回收底物的重復(fù)利用將正己烷洗脫相用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去正己烷即得回收底物異丁香酚.將回收底物與新用原料

15、底物進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化對(duì)比實(shí)驗(yàn)，底物濃度為20gL.轉(zhuǎn)化結(jié)果見(jiàn)表6.由表可知，回收底物再利用效果較好，轉(zhuǎn)化率相當(dāng)于新用原料底物的80.6%.可以用新舊底物循環(huán)混合反應(yīng)的方法進(jìn)一步提高重復(fù)轉(zhuǎn)化率.表6回收底物重復(fù)利用與原料底物的酶轉(zhuǎn)化對(duì)比Table6ComparisonofenzymaticconversionratesbetweenreusedsubstratefreshsubstrateFreshsubstrateReusedsubstrat

16、eEnzymeEnzymewithresinEnzymeEnzymewithresinVanillinconc.(gL)1.8243.9361.4373.548Conversionrate(%)9.8421.237.9319.143:203:303:403:503:60050100150200250300350Washingoutisoeugenol(mg)Resinnhexane(gmL)3:203:303:403:503:60010