釀酒酵母對(duì)木質(zhì)纖維素水解液中抑制物香草醛耐受性機(jī)制的解析.pdf

1、木質(zhì)纖維素是地球上儲(chǔ)量豐富的可再生資源，以其為原料的生物煉制技術(shù)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。木質(zhì)纖維素原料需要經(jīng)過(guò)預(yù)處理以獲得可發(fā)酵的糖類(lèi)，而預(yù)處理環(huán)節(jié)不可避免地產(chǎn)生對(duì)微生物生長(zhǎng)不利的抑制物，主要有有機(jī)弱酸、呋喃醛類(lèi)和酚類(lèi)化合物。因此，提高微生物的耐受性是木質(zhì)纖維素生物煉制技術(shù)的瓶頸問(wèn)題之一。存在于木質(zhì)纖維素水解液中的酚類(lèi)化合物種類(lèi)繁多，對(duì)微生物的危害也強(qiáng)于其他兩類(lèi)抑制物，且相關(guān)研究較少。香草醛是木質(zhì)纖維素水解液中的一種主要酚類(lèi)化合物。

2、>　　釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是傳統(tǒng)乙醇生產(chǎn)菌，具有良好的生產(chǎn)性能，廣泛用于生物煉制底盤(pán)細(xì)胞改造，以生產(chǎn)第二代燃料乙醇及其他生物基化學(xué)品。本實(shí)驗(yàn)室前期工作對(duì)一株發(fā)酵性能良好的二倍體工業(yè)菌株NAN-27進(jìn)行EMS（甲基磺酸乙酯）誘變處理，得到一株木質(zhì)纖維素水解液耐受性有所提高的菌株EM-13，繼而對(duì)其在木質(zhì)纖維素水解液中進(jìn)行長(zhǎng)期適應(yīng)性馴化后，得到了一株香草醛高耐受性菌株EMV-8，且該菌株具有較高的還原

3、香草醛為低毒性的香草醇的能力。進(jìn)一步對(duì)EMV-8和NAN-27進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析?；诖?，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)技術(shù)，發(fā)掘EMV-8中香草醛耐受性相關(guān)元件（基因）。
　　本文主要研究進(jìn)展:
　　1.介導(dǎo)香草醛高耐受性氧化還原酶的鑒定與機(jī)制研究
　　釀酒酵母菌株自身能夠通過(guò)內(nèi)源氧化還原酶將香草醛還原成低毒的香草醇，這一能力與菌株的香草醛耐受性密切相關(guān)。有報(bào)道稱(chēng)醇脫氫酶Adh6p參與釀酒酵母中香草醛的還原，但與

4、出發(fā)菌株NAN-27相比，EMV-8中ADH6轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化。因此，本文的第一項(xiàng)工作是分析鑒定在EMV-8中與香草醛還原過(guò)程相關(guān)的氧化還原酶。我們首先聚焦的是在EMV-8中轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)2倍以上的67個(gè)氧化還原酶基因（與NAN-27相比），結(jié)合對(duì)這些基因的功能解讀，確定16個(gè)備選基因，連同ADH6一起進(jìn)行后續(xù)研究。由于二倍體工業(yè)酵母的基因操作較不便，我們?cè)谝子诨虿僮髑野l(fā)酵性能良好的單倍體實(shí)驗(yàn)室菌株CEN.PK102-3A中超表達(dá)備

5、選基因。在香草醛脅迫下，對(duì)超表達(dá)氧化還原酶的重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果顯示，其中5個(gè)基因?qū)︶劸平湍傅南悴萑└吣褪苄杂蟹e極作用，即:ADH6——醇脫氫酶Adh6p基因，ALD6——乙醛脫氫酶Ald6p基因，ZWF1—葡萄糖-6-磷酸脫氫酶Zwf1p基因，以及只有系統(tǒng)名的YNL134C——ALD6、YNL134C和YJR096W促進(jìn)釀酒酵母最大比生長(zhǎng)速率分別提高了177％、25％、15％和18％。而超表達(dá)ADH6和ZWF1，使釀酒酵母的香草

6、醛比消耗速率分別提高了800％和26％。
　　進(jìn)一步測(cè)定上述5個(gè)氧化還原酶的粗酶液以香草醛為底物的還原酶活性。結(jié)果顯示，與只表達(dá)空載體的對(duì)照菌株相比，Adh6p以NADPH為輔酶的香草醛還原酶活性提高了350％，YNL134C編碼的還原酶以NADH為輔酶的香草醛還原酶活性提高了153％，YJR096W編碼的還原酶以NADPH和NADH為輔酶的香草醛還原酶活性分別提高了69％和45％。進(jìn)一步分析超表達(dá)這5個(gè)氧化還原酶對(duì)細(xì)胞內(nèi)還原型/

7、氧化型輔酶比例的影響，結(jié)果顯示，超表達(dá)ALD6或ZWF1分別使細(xì)胞內(nèi)的NADPH/NADP+的比例提高了96％和55％，而超表達(dá)其他基因沒(méi)有改變輔酶還原型/氧化型的比例。
　　該研究結(jié)果豐富了提高釀酒酵母香草醛耐受性的氧化還原酶，并解析了這些氧化還原酶對(duì)香草醛的可能解毒機(jī)制:Adh6p及YJR096W和YNL134C編碼的還原酶直接還原香草醛;Ald6p和Zwflp提供更多的還原型輔酶(主要是NADPH)。
　　2.香草醛高

8、耐受性菌株EMV-8的基因組突變研究
　　本文進(jìn)一步對(duì)親本菌株NAN-27、過(guò)渡菌株EM-13和香草醛高耐受性菌株EMV-8進(jìn)行基因組測(cè)序，以挖掘EMV-8中香草醛耐受性相關(guān)的DNA突變。突變發(fā)生可以發(fā)生在編碼區(qū)和非編碼區(qū)，本文主要關(guān)注編碼區(qū)的突變。EM-13和EMV-8的編碼區(qū)序列分別與出發(fā)菌株NAN-27編碼區(qū)序列進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)一步排除兩株菌株共同突變的基因，得到僅在EMV-8中發(fā)生的突變基因:275個(gè)非同義SNP（單核苷酸多態(tài)

9、性）突變基因和11個(gè)InDel（插入或缺失）突變的基因。鑒于只有EMV-8的香草醛耐受性顯著提高，因而我們主要關(guān)注這些只在EMV-8中發(fā)生突變的基因。為排除基因組測(cè)序的誤差，對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行PCR及Sanger測(cè)序驗(yàn)證，在已驗(yàn)證的59個(gè)非同義SNP突變的基因中，有14個(gè)基因被證實(shí)發(fā)生突變。11個(gè)InDel突變基因中，有7個(gè)基因被證實(shí)發(fā)生InDel突變。對(duì)非同義SNP突變的基因驗(yàn)證工作還在進(jìn)行中，因此本文主要對(duì)InDel突變基因進(jìn)行功能驗(yàn)證

10、。
　　一般地，InDel突變主要是引起相關(guān)蛋白的功能喪失，因而，我們?cè)趩伪扼w實(shí)驗(yàn)室菌株BY4741（未選用第一部分工作所用CEN.PK102-3A菌株，是由于有組學(xué)數(shù)據(jù)顯示該菌株缺少了部分突變基因）中分別敲除7個(gè)InDel突變基因(MFG1、YNL195C、PAU17、YVH1、PPM2、YRR1和RBG1)，產(chǎn)生的缺失突變體在含香草醛的平板上進(jìn)行菌體梯度定量生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，YRR1缺失突變體BY4741(yrr1Δ)表現(xiàn)出

11、良好的香草醛耐受性。同時(shí)，液體發(fā)酵結(jié)果顯示，在香草醛脅迫條件下，BY4741(yrr1Δ)的最大比生長(zhǎng)速率和香草醛的比消耗速率分別比出發(fā)菌株BY4741提高了142％和50％。進(jìn)一步，在缺失菌株BY4741(yrr1Δ)，通過(guò)質(zhì)粒回補(bǔ)該基因時(shí)，菌株香草醛耐受性則明顯下降，證實(shí)了其編碼蛋白Yrr1p對(duì)香草醛耐受性的不利作用。
　　YRR1編碼具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子Yrr1p，能夠激活多藥抗性相關(guān)基因的表達(dá)。此前相關(guān)研究報(bào)道均顯示Yr

12、r1p對(duì)細(xì)胞的藥物(4-硝基喹啉-N-氧化物、水楊酸、戴森錳鋅等)耐受性具有積極作用。本文首次觀察到Y(jié)rr1p對(duì)香草醛耐受性具有負(fù)面作用。
　　3.轉(zhuǎn)錄因子基因YRR1缺失提高香草醛耐受性機(jī)制的研究
　　鑒于YRR1編碼蛋白Yrr1p是藥物耐受性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，本文利用RNA-Seq技術(shù)，在有或無(wú)香草醛脅迫條件下對(duì)BY4741和BY4741(yrr1Δ)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。結(jié)果顯示，在無(wú)香草醛脅迫的條件下，YRR1缺失引起的

13、基因差異表達(dá)并不顯著。在香草醛脅迫的條件下，BY4741和BY4741(yrr1Δ)間共有217個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯變化。對(duì)這217個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能聚類(lèi)分析，這些基因的功能主要涉及氧化還原酶、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、rRNA加工和核糖體合成等生物學(xué)過(guò)程。根據(jù)差異表達(dá)顯著程度，并主要結(jié)合對(duì)相關(guān)基因的功能解讀，本文選定醇脫氫酶編碼基因ADH7，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因PDR5和SNQ2，及rRNA加工和核糖體合成相關(guān)基因NMD3、SSF1、NSR

14、1、DBP2、DBP9、HAS1、PRP43、MTR4為目標(biāo)進(jìn)一步研究。
　　YRR1缺失提高了菌株還原香草醛的能力。在香草醛脅迫下，已報(bào)道能有效催化香草醛還原的醇脫氫酶基因ADH7在菌株BY4741(yrr1Δ)中的表達(dá)水平是野生型對(duì)照菌株中的7倍。為此，在該脅迫條件下，分別測(cè)定BY4741和BY4741(yrr1Δ)的細(xì)胞粗酶液以香草醛為底物的還原酶活性。結(jié)果表明，BY4741(yrr1Δ)的粗酶液以NADPH為輔酶的香草醛還

15、原酶活性較出發(fā)菌株BY4741高出95％。結(jié)合BY4741(yrr1Δ)的香草醛比消耗速率較BY4741提高的現(xiàn)象，表明，提高菌株還原香草醛的能力是YRR1缺失提高香草醛耐受性的機(jī)制之一。在BY4741(yrr1Δ)菌株中進(jìn)一步敲除ADH7，BY4741(yrr1Δadh7Δ)依然表現(xiàn)出良好的香草醛耐受性，這說(shuō)明BY4741(yrr1Δ)中還有其他基因?qū)ο悴萑┠褪苄云鹱饔谩?br>　　YRR1缺失強(qiáng)化了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。在香草醛脅迫

16、條件下，與出發(fā)菌株BY4741相比，BY4741(yrr1Δ)中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因PDR5和SNQ2表達(dá)水平升高。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠外排毒性物質(zhì)。因此，在BY4741菌株中超表達(dá)了PDR5和SNQ2。結(jié)果顯示，超表達(dá)這些ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在無(wú)香草醛脅迫時(shí)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。但在香草醛脅迫下，超表達(dá)PDR5和SNQ2加快了菌體生長(zhǎng)，菌株延滯期縮短。因此，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量提高是YRR1缺失提高菌株對(duì)香草醛的耐受性的機(jī)制之一。
　　YRR

17、1缺失促進(jìn)了核糖體合成及rRNA加工過(guò)程，其中提高RNA解旋酶基因DBP2的表達(dá)水平對(duì)菌株香草醛耐受性有積極作用。香草醛嚴(yán)重抑制野生型菌株BY4741的核糖體合成途徑和rRNA加工過(guò)程。與之形成對(duì)比的是，在香草醛存在條件下，缺失YRR1解除了這種抑制，大約12％的核糖體合成相關(guān)的基因在BY4741(yrr1Δ)響應(yīng)香草醛時(shí)發(fā)生上調(diào)。其中4個(gè)基因(SSF1、NMD3、NSR1和DBP2)，在BY4741(yrr1Δ)響應(yīng)香草醛時(shí)（與無(wú)抑制

18、物條件比較）表達(dá)上調(diào)，而在BY4741響應(yīng)香草醛時(shí)（與無(wú)抑制物條件比較）表達(dá)下調(diào)，呈現(xiàn)相反的變化。這一相反變化可能是YRR1缺失引起的。在BY4741中分別超表達(dá)這4個(gè)基因，并在香草醛的脅迫下，進(jìn)行液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，超表達(dá)RNA解旋酶基因DBP2能夠顯著提高菌株的香草醛耐受性，菌株的最大比生長(zhǎng)速率和香草醛比消耗速率分別提高了7％和59％。其他基因?qū)甑南悴萑┠褪苄詻](méi)有影響。
　　RNA解旋酶能夠參與細(xì)胞內(nèi)一切RNA相關(guān)的活

19、動(dòng)，包括核糖體大小亞基(60S和40S)的合成。Dbp2p參與核糖體大亞基合成。香草醛被報(bào)道可以抑制核糖體大亞基合成，因此推測(cè)Dbp2p在香草醛耐受性中起到了加強(qiáng)核糖體大亞基合成的作用。同時(shí)，本文也關(guān)注了在BY4741(yrr1Δ)中表達(dá)上調(diào)的其它RNA解旋酶基因。按照它們參與的生物學(xué)過(guò)程，對(duì)參與大亞基合成的MTR4、DBP9，同時(shí)參與大小亞基合成的PRP43、HAS1，以及只參與小亞基合成的DBP4進(jìn)行功能驗(yàn)證，遺憾的是這些基因的超表

20、達(dá)并沒(méi)有提高菌株的香草醛耐受性。
　　綜上所述，本文通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)，在綜合分析大數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合遺傳學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)，挖掘出釀酒酵母提高香草醛耐受性的新元件:氧化還原酶Ald6p、Zwf1p以及YNL134C和YJR096W編碼的蛋白，轉(zhuǎn)錄因子Yrr1p，RNA解旋酶Dbp2p，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pdr5p和Snq2p。首次證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子Yrr1p對(duì)香草醛耐受性的具有負(fù)面作用，并證實(shí)一些ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、參與核糖體合成及rRN