細(xì)胞凍存的方法與步驟

1、細(xì)胞凍存、解凍方法與細(xì)胞計(jì)數(shù)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕科李晶〖返回主頁(yè)〗一、細(xì)胞冷凍保存一、細(xì)胞冷凍保存1.材料：生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO(SigmaDMSO(SigmaD2650)D2650)、無(wú)菌塑料冷凍保存管(Nalgene50000020)、0.4％（wv）trypanblue(GibcoBRL15250061)、血球計(jì)數(shù)盤(pán)與蓋玻片、等速降溫機(jī)(KRYO10SeriesII)2、冷凍保存方法：（1）傳統(tǒng)方法:冷存管置于

2、4℃10分鐘20℃30分鐘80℃16～18小時(shí)(或隔夜)液氮槽vapphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。20℃不可超過(guò)1小時(shí)，以防止胞內(nèi)冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（2）程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)等速降溫機(jī)以1～3℃分鐘之速度由室溫降至（80℃以下）120℃，再放在液氮槽vapphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。3、步驟：（1）冷凍前2448小時(shí)更換半量或全

3、量培養(yǎng)基，使細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期。（2）配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養(yǎng)基、血清，逐滴加入二甲基亞砜（DMSO）至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。（3）離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。（4）取與細(xì)胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液，并晃動(dòng)試管，制成細(xì)胞凍存懸液（DMSO最后濃度為5～10％），使細(xì)胞濃度為1～5106cel

4、lsml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，1～2mlvial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。嚴(yán)密封口后，注明細(xì)胞名稱(chēng)、代數(shù)、日期。然后進(jìn)行凍存。4、注意事項(xiàng)：（1）欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好(logphase)且存活率高之狀態(tài)，約為80～90％致密度。冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。（5）取出解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培

5、養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10～1:15)，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試。（6）解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO或glycerol)，依細(xì)胞種類(lèi)而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有510ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（7）若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培

6、養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。三、細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試三、細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試1、原理：（1）計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤(pán)或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。（2）血球計(jì)數(shù)盤(pán)一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm20.1mm=1.0x104ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘

7、以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。（3）存活測(cè)試之步驟為dyeexclusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無(wú)法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypanblue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypanblue，則用紅色之Erythrosinbluish。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)（活細(xì)胞數(shù)死細(xì)胞數(shù)）100%。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時(shí)間延長(zhǎng)，部分活細(xì)胞也開(kāi)始攝取染料；因?yàn)榕_(tái)盼蘭對(duì)蛋白質(zhì)有

8、很強(qiáng)的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。2、材料：0.4%wvtrypanblue(GibcoBRL15250061)；Erythosinbluishstain；取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH3647)溶于100mlCaMgfreesaline；血球計(jì)數(shù)盤(pán)及蓋玻片(Hemocytometercov

9、erslip)；計(jì)數(shù)器(counter)；低倍倒立顯微鏡；粒子計(jì)數(shù)器(CoultercounterCoulterElectronics)。白細(xì)胞稀釋液（4%乙酸溶液）。3、步驟：、步驟：（1）取50μl細(xì)胞懸浮液與50μltrypanblue(Erythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。（2）取少許混合液(約15μl)自血球計(jì)數(shù)盤(pán)chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色