第五講_組培應(yīng)用

1、植物組織培養(yǎng)應(yīng)用,組培快繁,脫毒,超低溫保存,人工種子,組培快繁,組培快繁,組織培養(yǎng)快速繁殖（rapid propogation），又稱離體快繁（in vitro rapid propagation），是指將植物材料放在試管內(nèi)，給予人工培養(yǎng)基合適的條件，以達(dá)到高速增殖的目的，所以也稱為快速無性繁殖（rapid clonal propagation）。,為什么要快繁？,有些植物由于收種困難或種子的發(fā)芽率很低；栽種時(shí)耗種量大，繁殖系數(shù)低，

2、如，貝母、番紅花；組培方法獲得無毒苗；節(jié)省土地，10萬株苗/30平米；,1 快繁體系的建立,1）無菌株系材料的選擇選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w對(duì)于快速繁殖能否成功非常重要，對(duì)于快速繁殖的藥用植物品種，一般應(yīng)選擇生產(chǎn)上大量推廣使用的具有優(yōu)良性狀或能預(yù)見未來有商業(yè)開發(fā)前景的品種。,,選用接種外植體時(shí)，應(yīng)采摘具有本品種特征，且生長健壯的植株幼嫩部位，比較好的是莖尖。莖尖形態(tài)已基本形成，生長速度快，遺傳性狀穩(wěn)定，但是莖尖往往受到材料來源的限制；

3、帶頂芽或腋芽的幼嫩莖段或枝條也可以作為外植體。,取材時(shí)應(yīng)該考慮的問題,a，外植體大小外植體的大小通常由培養(yǎng)的目的決定?？旆保簬б秆康那o段或枝條，0.5cm左右，過小易死 亡，過大不容易誘導(dǎo)分化出芽而且易污染；脫毒：需要使用頂端分生組織，外植體越小感染病毒 機(jī)會(huì)越小，但培養(yǎng)難度加大，反之亦然。,,b，植株的生理狀態(tài)一般取芽已膨大但芽鱗還未張開時(shí)最為合適，此時(shí)芽生長旺盛，并有芽鱗片的保護(hù)，不易污染；對(duì)于某

4、些需要低溫、高溫或特殊處理才能打破休眠的塊莖、鱗莖、球莖，常常需要處理后才能剝?nèi)∏o尖進(jìn)行培養(yǎng)。,,c，芽在植株上的部位芽：頂芽、側(cè)芽、腋芽在一些草本植物（如菊花，香石竹）中，使用頂芽或上部的芽做分生組織成功率常常比側(cè)芽或基部的芽要高。木本植物中常用腋芽做材料，性狀穩(wěn)定，再生所需時(shí)間短，再生植株健壯，適應(yīng)強(qiáng),,d，取材植株的年齡供體植株的年齡對(duì)不定芽和愈傷組織的形成影響明顯；幼齡株：繁殖系數(shù)高；老齡株：繁殖系數(shù)下降

5、多年生木本植物隨樹齡增加，分生組織、莖尖和芽的培養(yǎng)困難很多。,材料除菌接種,材料表面清洗殺菌劑消毒：升汞/次氯酸鈉消毒后在無菌條件下切成合適大小的小段，接種到培養(yǎng)基上。,芽的增殖,芽增殖的4種方式1 通過頂芽或腋芽直接產(chǎn)生叢生芽；2 誘導(dǎo)不定芽增殖分化；3 誘導(dǎo)不定體胚的產(chǎn)生4 先誘導(dǎo)愈傷組織，然后增殖愈傷分化成株,壯苗與生根,壯苗培養(yǎng)：不加或少加激素，促使幼苗健壯；生根培養(yǎng)：基本培養(yǎng)基加低濃度或不加細(xì)胞分裂素，高濃度

6、生長素。細(xì)胞分裂素/生長素高有利于芽生長；細(xì)胞分裂素/生長素低有利于根生長；,馴化、移栽,a，保持水分；b，選擇合適的種植介質(zhì)：疏松通氣、保水，容易滅菌，如蛭石、沙子、谷殼、鋸末等。c，防止菌類滋生：使用殺菌劑d，光照溫度：試管苗從異養(yǎng)到自養(yǎng)，光照不能太弱適宜溫度18~25度。,脫毒,植物的脫毒培養(yǎng),在植物生產(chǎn)中，病毒病是危害植物產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素。,,以無性繁殖方式為主的植物品種，在自然環(huán)境中長期經(jīng)受各

7、種病毒病的重復(fù)傳播，導(dǎo)致結(jié)果：光合作用減弱；生長勢(shì)變?nèi)?；品種退化；產(chǎn)量降低，減產(chǎn)30%以上。常見病毒病，黑斑病、花葉病、皺縮病,病毒的診斷,局部癥狀：病毒沿侵染點(diǎn)周圍產(chǎn)生斑點(diǎn)，分褪綠斑、壞死斑、環(huán)狀斑；系統(tǒng)癥狀：病毒侵染寄主后能夠在整個(gè)植株中運(yùn)輸并產(chǎn)生危害，在葉片、莖、果等組織中產(chǎn)生危害。,植物受病毒危害后的外部癥狀,植株變?。喊s、矮化、叢簇和扭曲，有時(shí)病毒侵染后不表現(xiàn)明顯性狀，稱為潛伏侵染。植株矮

8、化常減小葉片大小、葉間距以及葉片數(shù)減小，也可能引起果實(shí)種子變小。,,葉片癥狀：花葉癥狀，病毒侵染后葉片不均勻褪綠；黃化癥狀，侵染病毒后葉片變黃；環(huán)斑及蝕紋，葉片出現(xiàn)單環(huán)紋或雙環(huán)紋環(huán)斑，葉片上出現(xiàn)不規(guī)則紋線癥狀稱為蝕紋。,,,發(fā)育異?；?，葉片扭曲、皺縮、卷葉壞死，整個(gè)組織、器官或植株死亡,如何應(yīng)對(duì)病毒病,對(duì)于病毒病，目前并無有效防治措施；利用莖尖分生組織脫毒培養(yǎng)，可以獲得脫毒苗，恢復(fù)植物固有的優(yōu)良性狀。脫毒苗再通

9、過克隆繁殖可以獲得大量脫毒的優(yōu)良種，供生產(chǎn)上使用。,脫毒技術(shù)1,熱處理脫毒利用病毒和寄主植物對(duì)高溫的忍耐程度差異，使植物的生長速度超過病毒的擴(kuò)散速度，得到一小部分不含病毒的分生組織，進(jìn)行無毒個(gè)體培養(yǎng)。熱處理脫毒的原理：將植物置于高于正常溫度環(huán)境中，組織內(nèi)部病毒部分或全部鈍化，但寄主植物細(xì)胞很少或不受到傷害。,,高溫鈍化病毒主要表現(xiàn)在：高溫可斷裂病毒RNA；病毒內(nèi)部酶裂解，造成病毒顆粒破壞；輔助酶鈍化，如RNA聚合酶鈍化

10、導(dǎo)致RNA合成受阻；高溫下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，病毒不能正確組裝；,,熱處理脫毒處理溫度的時(shí)間因物種和器官的生理狀態(tài)而異，一般35~40小時(shí)，短則幾十分鐘，長可達(dá)數(shù)月。,熱處理方法,熱水處理：熱水處理對(duì)休眠芽效果比較好熱空氣處理：對(duì)活躍生長的莖尖效果好，既能消除病毒，也能使寄主植物有較高的存活機(jī)率。把旺盛生長的植物轉(zhuǎn)移到35~40度的熱療室處理一定時(shí)間，熱處理后要立刻把莖尖切下來嫁接到無病的砧木上。,熱處理脫毒的局限性,并

11、非所有的病毒都對(duì)熱處理敏感；延長寄主植物的熱處理時(shí)間，也會(huì)鈍化植物組織中的抗性因子；熱處理以后僅有一小部分植株能夠存活。,脫毒技術(shù)2,2 莖尖脫毒培養(yǎng)植物莖尖不存在病毒，或病毒數(shù)量、種類少；病毒的復(fù)制速度不及莖尖細(xì)胞的生長速度，病毒難以進(jìn)入到分生組織中。莖尖培養(yǎng)是生產(chǎn)無毒植株最重要、最有效的組培方法，在草本植物上廣泛應(yīng)用，在十幾種木本植物上也取得了成功。,脫毒培養(yǎng)的方法,1從帶病植株上切取莖尖、芽尖作為外植體，常規(guī)消毒

12、后在培養(yǎng)基上培養(yǎng)成小植株，經(jīng)過脫毒檢測(cè)以后，將脫毒苗移栽到隔離區(qū)種植，作為原種繁殖。,,2 愈傷組織脫毒培養(yǎng)莖尖分生組織培養(yǎng)一個(gè)莖尖只能得到一株無毒苗，對(duì)繁殖率低的植物而言效率不高，如果先用組織培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織，再從愈傷組織分化出無病毒植株，效率提高。,愈傷組織脫毒的原因,a，感染病毒的愈傷組織內(nèi)還存在部分無病毒細(xì)胞；b，感染病毒的愈傷組織在分裂過程中產(chǎn)生新的無病毒細(xì)胞；c，愈傷組織中細(xì)胞之間的胞間聯(lián)系減少，缺乏輸導(dǎo)組織，病毒傳

13、導(dǎo)受限；d，通過連續(xù)的繼代，選擇了無病毒的或含有少量病毒的細(xì)胞簇。,,3 原生質(zhì)體脫病毒培養(yǎng)類似于愈傷組織脫毒，Shepard報(bào)道得到4140株煙草再生植株，7.5%為無毒植株。4 繁殖組織脫毒培養(yǎng)利用花組織培養(yǎng)獲得無毒株。如珠心、胚珠，病毒不能進(jìn)入珠心和胚珠。,,5 莖尖顯微嫁接脫毒木本植物莖尖分生組織脫毒培養(yǎng)屢遭失敗，后來提出一種顯微嫁接技術(shù)。具體做法：將砧木種子經(jīng)消毒后播于MS培養(yǎng)基，生長2周以后，把莖

14、尖分生組織熱脫毒后再嫁接到砧木上。,莖尖脫毒的理論基礎(chǔ),莖尖培養(yǎng)之所以能獲得無毒苗，是由于病毒在植物體內(nèi)分布不均勻，在頂端分生組織中是無毒的；病毒靠維管系統(tǒng)傳播移動(dòng)，分生組織中還沒有形成維管束，病毒只能通過胞間連絲移動(dòng)；分生組織代謝旺盛，鈍化病毒的活性較高；頂端分生組織高濃度的激素濃度可能會(huì)抑制病毒增殖。,莖尖脫毒技術(shù)要領(lǐng),1 莖尖的剝?nèi)∠竞蟮牟牧戏旁诮馄淑R下，用解剖針或解剖刀把分生組織剝?nèi)∠聛?，迅速放入莖尖培養(yǎng)基中。如

15、果在空氣中暴露時(shí)間過長，會(huì)失水死亡。剝?nèi)∏o尖的原則是既要脫掉病毒，又要使莖尖容易成活，一般以0.1mm~1mm之間為宜。離體莖尖越大越容易成活，但病毒越難根除。,,2 選用合適的培養(yǎng)基和激素莖尖剝離后一般采用低激素濃度的固體培養(yǎng)基；兩階段培養(yǎng)：第一階段，以保證莖尖成活為主要目的；第二階段，莖尖成活以后，長至2~3cm時(shí)更換培養(yǎng)基，以提高繁殖系數(shù)為主要目的。,,3 脫毒苗的移栽適合脫毒苗移栽的基質(zhì)有珍珠巖、

16、蛭石、泥沙等的混合物；幼苗健壯、有良好根系的苗容易成活；,,4 脫毒苗的田間管理脫毒苗移到大田以后，要特別嚴(yán)防病毒的再次感染。選好種植區(qū)，選在地勢(shì)好，排水良好的地塊；脫毒苗種植需建隔離網(wǎng)室，防止蚜蟲進(jìn)入；土傳病毒還要對(duì)土壤進(jìn)行消毒，周圍環(huán)境也要整潔；不在同一塊土地連作重茬。,病毒的復(fù)查,經(jīng)脫毒處理的植物還會(huì)有少量帶毒植株，所以要進(jìn)行復(fù)查。復(fù)查的方法,,a，指示植物法產(chǎn)生病狀特征的寄主植物稱為指示植物；具

17、體操作：將待檢測(cè)植物葉片加水和等量0.1M磷酸緩沖液（pH7.0）研磨成漿，然后混金剛砂末在指示植物葉面上輕輕摩擦，5min后清水清洗液面，放置自然生長觀察是否發(fā)病。,,b，抗血清鑒定法植物病毒由核酸和蛋白質(zhì)組成，表面蛋白是一種抗原，注射到動(dòng)物體內(nèi)即可產(chǎn)生抗體?？贵w存在于血清中稱為抗血清，血清中的抗體能與抗原特異結(jié)合。不同病毒抗原產(chǎn)生的抗體都是特異的，用已知的抗血清可以鑒定未知病毒。,c，ELISA（酶聯(lián)免疫法）,,d，

18、核酸分子雜交,核酸分子雜交的基本原理：同源的2條核酸序列在一定條件下可以按照堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈；根據(jù)使用的方法，被檢測(cè)的核酸可以是提純的，也可以是在細(xì)胞內(nèi)雜交（原位雜交）；雜交探針：放射性標(biāo)記或生物素、地高辛標(biāo)記。,e，PCR檢測(cè),靈敏度高，特異性強(qiáng)缺點(diǎn)是易污染,超低溫保存,植物資源的超低溫保存,生物體的遺傳物質(zhì)從上一代傳給子代，攜帶遺傳物質(zhì)的材料稱為種質(zhì)。這種攜帶遺傳物質(zhì)的材料，包括植物種子、根莖、塊莖、樹木苗木

19、等統(tǒng)稱為種質(zhì)資源，也稱為遺傳資源或基因資源。,,狹義的生物種質(zhì)資源包括全部動(dòng)植物家養(yǎng)品種、地方品種、新育成種以及育成的品系和遺傳材料。廣義的種質(zhì)資源是指地球上所有生物種質(zhì)的遺傳資源。,植物組培種質(zhì)資源保存概述,利用組織培養(yǎng)技術(shù)保存種質(zhì)資源用相對(duì)較小的空間保存大量的種質(zhì)；免遭病蟲害侵襲；對(duì)于特殊材料，如遠(yuǎn)緣雜交后代、體細(xì)胞雜交種更適合用組織培養(yǎng)的方式保存；保存的種質(zhì)便于交換和分發(fā)，減少檢疫手續(xù)。,植物資源的超低溫保存,種質(zhì)資源超低

20、溫保存是指在-80度以下的超低溫中保存種質(zhì)資源的技術(shù)；超低溫獲得途徑：干冰-79度超低溫冰箱-80度液氮-196度,,超低溫下保存的材料代謝可以大大減慢、甚至終止代謝和衰老過程，保持生物材料的穩(wěn)定性；超低溫保存種質(zhì)時(shí)常用液氮做冷源，凍存的設(shè)備是液氮罐，除了每隔40~60天補(bǔ)充1次液氮不需要空調(diào)設(shè)備和其它昂貴設(shè)備，所需費(fèi)用低廉，節(jié)約人力物力，所以在超低溫保存中，液氮冷凍使用最多。,影響超低溫保存的因素,1

21、植物材料的特性冷凍前植物材料基因型的差異以及植物組織、細(xì)胞的生理狀態(tài)是決定冷凍細(xì)胞活力的重要因素。一般來說，高細(xì)胞質(zhì)、無液泡、薄壁的分生細(xì)胞存活率高于含大量液泡的大細(xì)胞；懸浮培養(yǎng)細(xì)胞處于指數(shù)生長期的細(xì)胞能得到最高的存活率，這時(shí)多數(shù)細(xì)胞處在比較理想的狀態(tài)。,,2 冰凍前的預(yù)處理對(duì)材料進(jìn)行抗旱鍛煉或預(yù)培養(yǎng)能增強(qiáng)細(xì)胞的存活率。預(yù)處理措施：繼代及同步培養(yǎng)；在高滲或冰凍保護(hù)劑培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)；零上低溫馴化,,3 冰凍

22、保護(hù)劑冰凍保護(hù)劑的使用能減少超低溫保存造成的傷害。保護(hù)劑的作用：降低冰點(diǎn)；增強(qiáng)溶液黏性，防止冰晶生長；促進(jìn)細(xì)胞在結(jié)冰早期進(jìn)行保護(hù)性脫水。常用的冰凍保護(hù)劑DMSO、甘油,,4 冷凍速度慢凍法：樣品以0.1~10度/min的速度緩慢降至-30~-40度，平衡一段時(shí)間后轉(zhuǎn)入液氮保存；適用于懸浮細(xì)胞和原生質(zhì)體。快凍法：直接投入液氮中冷凍，溫度下降速度300~1000度/min；適合含水量比較少的材料，如花

23、粉、種子、枝條。,,逐級(jí)冷凍法：起先以較慢降低速度降溫使細(xì)胞失水達(dá)到保護(hù)性的脫水，形成高濃度的溶質(zhì)，然后分級(jí)降至-30度、-70度、-100度、-196度。干凍法：通過控制脫水速度和脫水程度，對(duì)植物材料進(jìn)行干燥處理能增強(qiáng)抗凍性。一般用真空干燥法進(jìn)行干燥，干燥后投入液氮保存。,,5 貯存從理論上講，只要保證不斷補(bǔ)充液氮，就可以長期保存冷凍的材料。但是有文獻(xiàn)報(bào)道，隨著時(shí)間的延長，冷凍莖尖的生活力下降。,,6 解凍貯藏于液氮

24、中固定樣品，緩慢升溫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)再次結(jié)冰，危險(xiǎn)區(qū)大概在-50~-10度。實(shí)驗(yàn)表明，冰凍過的材料在35~40度水浴中解凍比在室溫解凍效果好。冰凍的材料細(xì)胞很脆弱，解凍時(shí)應(yīng)避免劇烈搖動(dòng)。,,7 解凍后的處理解凍后殘留于細(xì)胞的冰凍保護(hù)劑會(huì)影響材料的恢復(fù)生長，所以需要除去保護(hù)劑；但是沒有必要連續(xù)洗滌，多次洗滌對(duì)細(xì)胞的傷害往往會(huì)更大。,,8 解凍后活力測(cè)定再培養(yǎng)；FDA染色；TTC染色：檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脫氫酶活性,人工種子,

25、體細(xì)胞胚與人工種子,體細(xì)胞胚是由植物體細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的類似于合子胚的結(jié)構(gòu)；把離體培養(yǎng)產(chǎn)生的體細(xì)胞胚或能夠發(fā)育成完整植株的分生組織包埋在含有營養(yǎng)物質(zhì)和具有保護(hù)作用的外殼中，在適宜的條件下就可以長出幼苗，這種類似于天然種子的結(jié)構(gòu)稱為人工種子。,人工種子的結(jié)構(gòu),1 胚狀體類似于天然種子的胚，主要是組培產(chǎn)生的胚狀體、愈傷組織、小鱗莖等；2 人工胚乳相當(dāng)于組培中的培養(yǎng)基，提供營養(yǎng)和激素；3 人工種皮透水透氣，固定成型，耐受機(jī)械損傷