第五講_組培應用

1、植物組織培養(yǎng)應用,組培快繁,脫毒,超低溫保存,人工種子,組培快繁,組培快繁,組織培養(yǎng)快速繁殖（rapid propogation），又稱離體快繁（in vitro rapid propagation），是指將植物材料放在試管內，給予人工培養(yǎng)基合適的條件，以達到高速增殖的目的，所以也稱為快速無性繁殖（rapid clonal propagation）。,為什么要快繁？,有些植物由于收種困難或種子的發(fā)芽率很低；栽種時耗種量大，繁殖系數(shù)低，

2、如，貝母、番紅花；組培方法獲得無毒苗；節(jié)省土地，10萬株苗/30平米；,1 快繁體系的建立,1）無菌株系材料的選擇選擇適當?shù)耐庵搀w對于快速繁殖能否成功非常重要，對于快速繁殖的藥用植物品種，一般應選擇生產(chǎn)上大量推廣使用的具有優(yōu)良性狀或能預見未來有商業(yè)開發(fā)前景的品種。,,選用接種外植體時，應采摘具有本品種特征，且生長健壯的植株幼嫩部位，比較好的是莖尖。莖尖形態(tài)已基本形成，生長速度快，遺傳性狀穩(wěn)定，但是莖尖往往受到材料來源的限制；

3、帶頂芽或腋芽的幼嫩莖段或枝條也可以作為外植體。,取材時應該考慮的問題,a，外植體大小外植體的大小通常由培養(yǎng)的目的決定?？旆保簬б秆康那o段或枝條，0.5cm左右，過小易死 亡，過大不容易誘導分化出芽而且易污染；脫毒：需要使用頂端分生組織，外植體越小感染病毒 機會越小，但培養(yǎng)難度加大，反之亦然。,,b，植株的生理狀態(tài)一般取芽已膨大但芽鱗還未張開時最為合適，此時芽生長旺盛，并有芽鱗片的保護，不易污染；對于某

4、些需要低溫、高溫或特殊處理才能打破休眠的塊莖、鱗莖、球莖，常常需要處理后才能剝取莖尖進行培養(yǎng)。,,c，芽在植株上的部位芽：頂芽、側芽、腋芽在一些草本植物（如菊花，香石竹）中，使用頂芽或上部的芽做分生組織成功率常常比側芽或基部的芽要高。木本植物中常用腋芽做材料，性狀穩(wěn)定，再生所需時間短，再生植株健壯，適應強,,d，取材植株的年齡供體植株的年齡對不定芽和愈傷組織的形成影響明顯；幼齡株：繁殖系數(shù)高；老齡株：繁殖系數(shù)下降

5、多年生木本植物隨樹齡增加，分生組織、莖尖和芽的培養(yǎng)困難很多。,材料除菌接種,材料表面清洗殺菌劑消毒：升汞/次氯酸鈉消毒后在無菌條件下切成合適大小的小段，接種到培養(yǎng)基上。,芽的增殖,芽增殖的4種方式1 通過頂芽或腋芽直接產(chǎn)生叢生芽；2 誘導不定芽增殖分化；3 誘導不定體胚的產(chǎn)生4 先誘導愈傷組織，然后增殖愈傷分化成株,壯苗與生根,壯苗培養(yǎng)：不加或少加激素，促使幼苗健壯；生根培養(yǎng)：基本培養(yǎng)基加低濃度或不加細胞分裂素，高濃度

6、生長素。細胞分裂素/生長素高有利于芽生長；細胞分裂素/生長素低有利于根生長；,馴化、移栽,a，保持水分；b，選擇合適的種植介質：疏松通氣、保水，容易滅菌，如蛭石、沙子、谷殼、鋸末等。c，防止菌類滋生：使用殺菌劑d，光照溫度：試管苗從異養(yǎng)到自養(yǎng)，光照不能太弱適宜溫度18~25度。,脫毒,植物的脫毒培養(yǎng),在植物生產(chǎn)中，病毒病是危害植物產(chǎn)量和質量的重要因素。,,以無性繁殖方式為主的植物品種，在自然環(huán)境中長期經(jīng)受各

7、種病毒病的重復傳播，導致結果：光合作用減弱；生長勢變弱；品種退化；產(chǎn)量降低，減產(chǎn)30%以上。常見病毒病，黑斑病、花葉病、皺縮病,病毒的診斷,局部癥狀：病毒沿侵染點周圍產(chǎn)生斑點，分褪綠斑、壞死斑、環(huán)狀斑；系統(tǒng)癥狀：病毒侵染寄主后能夠在整個植株中運輸并產(chǎn)生危害，在葉片、莖、果等組織中產(chǎn)生危害。,植物受病毒危害后的外部癥狀,植株變?。喊s、矮化、叢簇和扭曲，有時病毒侵染后不表現(xiàn)明顯性狀，稱為潛伏侵染。植株矮

8、化常減小葉片大小、葉間距以及葉片數(shù)減小，也可能引起果實種子變小。,,葉片癥狀：花葉癥狀，病毒侵染后葉片不均勻褪綠；黃化癥狀，侵染病毒后葉片變黃；環(huán)斑及蝕紋，葉片出現(xiàn)單環(huán)紋或雙環(huán)紋環(huán)斑，葉片上出現(xiàn)不規(guī)則紋線癥狀稱為蝕紋。,,,發(fā)育異?；?，葉片扭曲、皺縮、卷葉壞死，整個組織、器官或植株死亡,如何應對病毒病,對于病毒病，目前并無有效防治措施；利用莖尖分生組織脫毒培養(yǎng)，可以獲得脫毒苗，恢復植物固有的優(yōu)良性狀。脫毒苗再通

9、過克隆繁殖可以獲得大量脫毒的優(yōu)良種，供生產(chǎn)上使用。,脫毒技術1,熱處理脫毒利用病毒和寄主植物對高溫的忍耐程度差異，使植物的生長速度超過病毒的擴散速度，得到一小部分不含病毒的分生組織，進行無毒個體培養(yǎng)。熱處理脫毒的原理：將植物置于高于正常溫度環(huán)境中，組織內部病毒部分或全部鈍化，但寄主植物細胞很少或不受到傷害。,,高溫鈍化病毒主要表現(xiàn)在：高溫可斷裂病毒RNA；病毒內部酶裂解，造成病毒顆粒破壞；輔助酶鈍化，如RNA聚合酶鈍化

10、導致RNA合成受阻；高溫下蛋白質結構發(fā)生變化，病毒不能正確組裝；,,熱處理脫毒處理溫度的時間因物種和器官的生理狀態(tài)而異，一般35~40小時，短則幾十分鐘，長可達數(shù)月。,熱處理方法,熱水處理：熱水處理對休眠芽效果比較好熱空氣處理：對活躍生長的莖尖效果好，既能消除病毒，也能使寄主植物有較高的存活機率。把旺盛生長的植物轉移到35~40度的熱療室處理一定時間，熱處理后要立刻把莖尖切下來嫁接到無病的砧木上。,熱處理脫毒的局限性,并

11、非所有的病毒都對熱處理敏感；延長寄主植物的熱處理時間，也會鈍化植物組織中的抗性因子；熱處理以后僅有一小部分植株能夠存活。,脫毒技術2,2 莖尖脫毒培養(yǎng)植物莖尖不存在病毒，或病毒數(shù)量、種類少；病毒的復制速度不及莖尖細胞的生長速度，病毒難以進入到分生組織中。莖尖培養(yǎng)是生產(chǎn)無毒植株最重要、最有效的組培方法，在草本植物上廣泛應用，在十幾種木本植物上也取得了成功。,脫毒培養(yǎng)的方法,1從帶病植株上切取莖尖、芽尖作為外植體，常規(guī)消毒

12、后在培養(yǎng)基上培養(yǎng)成小植株，經(jīng)過脫毒檢測以后，將脫毒苗移栽到隔離區(qū)種植，作為原種繁殖。,,2 愈傷組織脫毒培養(yǎng)莖尖分生組織培養(yǎng)一個莖尖只能得到一株無毒苗，對繁殖率低的植物而言效率不高，如果先用組織培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織，再從愈傷組織分化出無病毒植株，效率提高。,愈傷組織脫毒的原因,a，感染病毒的愈傷組織內還存在部分無病毒細胞；b，感染病毒的愈傷組織在分裂過程中產(chǎn)生新的無病毒細胞；c，愈傷組織中細胞之間的胞間聯(lián)系減少，缺乏輸導組織，病毒傳

13、導受限；d，通過連續(xù)的繼代，選擇了無病毒的或含有少量病毒的細胞簇。,,3 原生質體脫病毒培養(yǎng)類似于愈傷組織脫毒，Shepard報道得到4140株煙草再生植株，7.5%為無毒植株。4 繁殖組織脫毒培養(yǎng)利用花組織培養(yǎng)獲得無毒株。如珠心、胚珠，病毒不能進入珠心和胚珠。,,5 莖尖顯微嫁接脫毒木本植物莖尖分生組織脫毒培養(yǎng)屢遭失敗，后來提出一種顯微嫁接技術。具體做法：將砧木種子經(jīng)消毒后播于MS培養(yǎng)基，生長2周以后，把莖

14、尖分生組織熱脫毒后再嫁接到砧木上。,莖尖脫毒的理論基礎,莖尖培養(yǎng)之所以能獲得無毒苗，是由于病毒在植物體內分布不均勻，在頂端分生組織中是無毒的；病毒靠維管系統(tǒng)傳播移動，分生組織中還沒有形成維管束，病毒只能通過胞間連絲移動；分生組織代謝旺盛，鈍化病毒的活性較高；頂端分生組織高濃度的激素濃度可能會抑制病毒增殖。,莖尖脫毒技術要領,1 莖尖的剝取消毒后的材料放在解剖鏡下，用解剖針或解剖刀把分生組織剝取下來，迅速放入莖尖培養(yǎng)基中。如

15、果在空氣中暴露時間過長，會失水死亡。剝取莖尖的原則是既要脫掉病毒，又要使莖尖容易成活，一般以0.1mm~1mm之間為宜。離體莖尖越大越容易成活，但病毒越難根除。,,2 選用合適的培養(yǎng)基和激素莖尖剝離后一般采用低激素濃度的固體培養(yǎng)基；兩階段培養(yǎng)：第一階段，以保證莖尖成活為主要目的；第二階段，莖尖成活以后，長至2~3cm時更換培養(yǎng)基，以提高繁殖系數(shù)為主要目的。,,3 脫毒苗的移栽適合脫毒苗移栽的基質有珍珠巖、

16、蛭石、泥沙等的混合物；幼苗健壯、有良好根系的苗容易成活；,,4 脫毒苗的田間管理脫毒苗移到大田以后，要特別嚴防病毒的再次感染。選好種植區(qū)，選在地勢好，排水良好的地塊；脫毒苗種植需建隔離網(wǎng)室，防止蚜蟲進入；土傳病毒還要對土壤進行消毒，周圍環(huán)境也要整潔；不在同一塊土地連作重茬。,病毒的復查,經(jīng)脫毒處理的植物還會有少量帶毒植株，所以要進行復查。復查的方法,,a，指示植物法產(chǎn)生病狀特征的寄主植物稱為指示植物；具

17、體操作：將待檢測植物葉片加水和等量0.1M磷酸緩沖液（pH7.0）研磨成漿，然后混金剛砂末在指示植物葉面上輕輕摩擦，5min后清水清洗液面，放置自然生長觀察是否發(fā)病。,,b，抗血清鑒定法植物病毒由核酸和蛋白質組成，表面蛋白是一種抗原，注射到動物體內即可產(chǎn)生抗體。抗體存在于血清中稱為抗血清，血清中的抗體能與抗原特異結合。不同病毒抗原產(chǎn)生的抗體都是特異的，用已知的抗血清可以鑒定未知病毒。,c，ELISA（酶聯(lián)免疫法）,,d，

18、核酸分子雜交,核酸分子雜交的基本原理：同源的2條核酸序列在一定條件下可以按照堿基互補原則退火形成雙鏈；根據(jù)使用的方法，被檢測的核酸可以是提純的，也可以是在細胞內雜交（原位雜交）；雜交探針：放射性標記或生物素、地高辛標記。,e，PCR檢測,靈敏度高，特異性強缺點是易污染,超低溫保存,植物資源的超低溫保存,生物體的遺傳物質從上一代傳給子代，攜帶遺傳物質的材料稱為種質。這種攜帶遺傳物質的材料，包括植物種子、根莖、塊莖、樹木苗木

19、等統(tǒng)稱為種質資源，也稱為遺傳資源或基因資源。,,狹義的生物種質資源包括全部動植物家養(yǎng)品種、地方品種、新育成種以及育成的品系和遺傳材料。廣義的種質資源是指地球上所有生物種質的遺傳資源。,植物組培種質資源保存概述,利用組織培養(yǎng)技術保存種質資源用相對較小的空間保存大量的種質；免遭病蟲害侵襲；對于特殊材料，如遠緣雜交后代、體細胞雜交種更適合用組織培養(yǎng)的方式保存；保存的種質便于交換和分發(fā)，減少檢疫手續(xù)。,植物資源的超低溫保存,種質資源超低

20、溫保存是指在-80度以下的超低溫中保存種質資源的技術；超低溫獲得途徑：干冰-79度超低溫冰箱-80度液氮-196度,,超低溫下保存的材料代謝可以大大減慢、甚至終止代謝和衰老過程，保持生物材料的穩(wěn)定性；超低溫保存種質時常用液氮做冷源，凍存的設備是液氮罐，除了每隔40~60天補充1次液氮不需要空調設備和其它昂貴設備，所需費用低廉，節(jié)約人力物力，所以在超低溫保存中，液氮冷凍使用最多。,影響超低溫保存的因素,1

21、植物材料的特性冷凍前植物材料基因型的差異以及植物組織、細胞的生理狀態(tài)是決定冷凍細胞活力的重要因素。一般來說，高細胞質、無液泡、薄壁的分生細胞存活率高于含大量液泡的大細胞；懸浮培養(yǎng)細胞處于指數(shù)生長期的細胞能得到最高的存活率，這時多數(shù)細胞處在比較理想的狀態(tài)。,,2 冰凍前的預處理對材料進行抗旱鍛煉或預培養(yǎng)能增強細胞的存活率。預處理措施：繼代及同步培養(yǎng)；在高滲或冰凍保護劑培養(yǎng)基上預培養(yǎng)；零上低溫馴化,,3 冰凍

22、保護劑冰凍保護劑的使用能減少超低溫保存造成的傷害。保護劑的作用：降低冰點；增強溶液黏性，防止冰晶生長；促進細胞在結冰早期進行保護性脫水。常用的冰凍保護劑DMSO、甘油,,4 冷凍速度慢凍法：樣品以0.1~10度/min的速度緩慢降至-30~-40度，平衡一段時間后轉入液氮保存；適用于懸浮細胞和原生質體。快凍法：直接投入液氮中冷凍，溫度下降速度300~1000度/min；適合含水量比較少的材料，如花

23、粉、種子、枝條。,,逐級冷凍法：起先以較慢降低速度降溫使細胞失水達到保護性的脫水，形成高濃度的溶質，然后分級降至-30度、-70度、-100度、-196度。干凍法：通過控制脫水速度和脫水程度，對植物材料進行干燥處理能增強抗凍性。一般用真空干燥法進行干燥，干燥后投入液氮保存。,,5 貯存從理論上講，只要保證不斷補充液氮，就可以長期保存冷凍的材料。但是有文獻報道，隨著時間的延長，冷凍莖尖的生活力下降。,,6 解凍貯藏于液氮

24、中固定樣品，緩慢升溫時，細胞內會再次結冰，危險區(qū)大概在-50~-10度。實驗表明，冰凍過的材料在35~40度水浴中解凍比在室溫解凍效果好。冰凍的材料細胞很脆弱，解凍時應避免劇烈搖動。,,7 解凍后的處理解凍后殘留于細胞的冰凍保護劑會影響材料的恢復生長，所以需要除去保護劑；但是沒有必要連續(xù)洗滌，多次洗滌對細胞的傷害往往會更大。,,8 解凍后活力測定再培養(yǎng)；FDA染色；TTC染色：檢測細胞內脫氫酶活性,人工種子,

25、體細胞胚與人工種子,體細胞胚是由植物體細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的類似于合子胚的結構；把離體培養(yǎng)產(chǎn)生的體細胞胚或能夠發(fā)育成完整植株的分生組織包埋在含有營養(yǎng)物質和具有保護作用的外殼中，在適宜的條件下就可以長出幼苗，這種類似于天然種子的結構稱為人工種子。,人工種子的結構,1 胚狀體類似于天然種子的胚，主要是組培產(chǎn)生的胚狀體、愈傷組織、小鱗莖等；2 人工胚乳相當于組培中的培養(yǎng)基，提供營養(yǎng)和激素；3 人工種皮透水透氣，固定成型，耐受機械損傷