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文檔簡介
1、砷是一種劇毒類金屬,在自然環(huán)境中主要以亞砷酸鹽(As(Ⅲ))和砷酸鹽(As(Ⅴ))的無機形式存在并通過微生物的氧化和還原相互轉(zhuǎn)化。As(Ⅲ)不帶電荷且移動性強,其毒性和危害性比As(Ⅴ)大很多,因而,微生物可以通過對砷的氧化還原轉(zhuǎn)化危害人類的健康和安全。本論文圍繞砷抗性細菌對As(Ⅲ)的氧化和細胞質(zhì)As(Ⅴ)的還原開展了以下兩方面的研究工作,主要結(jié)果如下:
在我國砷高污染TS區(qū)、中污染SY區(qū)、低污染LY區(qū)和YC區(qū)分別采集了
2、4個土壤樣品,從這4個代表3種不同砷污染水平土壤樣品中共分離到58株砷抗性菌(TS1-45、SY1-8、LY1-4和YC1),其中共有12株As(Ⅲ)高抗菌株(MICs>20 mM),并且都是從高污染TS區(qū)中分離得到,分布在Acinetobacter、Agrobacterium、Arthrobacter、Comamonas、Rhodococcus、Stenotrophomonas和Pseudomonas等7個屬。利用KMnO4法從58株
3、菌中檢測出5株As(Ⅲ)氧化菌(Achromobacter sp.SY8、Pseudomonas sp.TS44和Agrobacterium spp.TS43.TS45,LY4),它們的平均As(Ⅲ)抗性水平高于其余53株非As(Ⅲ)氧化菌。采用簡并PCR方法成功擴增出5個編碼As(Ⅲ)氧化酶大亞基aoxB片段和51個As(Ⅲ)通道蛋白基因片段(18個arsB、12個ACR3(1)和21個ACR3(2)),發(fā)現(xiàn)aoxB特異性存在于As(
4、Ⅲ)氧化菌中,而arsB、ACR3(1)和ACR3(2)在As(Ⅲ)氧化菌和非As(Ⅲ)氧化菌中都存在。采用鄰近距離法構(gòu)建了58株菌16S rRNA基因進化樹、5個aoxB和51個As(Ⅲ)通道蛋白基因的蛋白進化樹,詳細分析并比較了它們之間的進化關(guān)系,發(fā)現(xiàn)5個aoxB與其16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)生完全吻合,但有8個ACR3(2)和1個arsB與其16S rRNA基因的進化矛盾,很可能是水平基因轉(zhuǎn)移所致。研究還發(fā)現(xiàn)長期受砷污染的環(huán)境中
5、砷抗性菌的多樣性豐富而且As(Ⅲ)抗性水平高,進一步分析發(fā)現(xiàn)水平基因轉(zhuǎn)移加快了砷抗性菌的側(cè)向進化。本研究是對我國不同砷污染土壤中砷抗性菌及其抗性基因比較研究的首次報道,也是檢測As(Ⅲ)通道蛋白基因發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的首次報道。
以上述其中兩株As(Ⅲ)氧化菌新種Achromobacter sp.SY8和Pseudomonas sp.TS44為研究對象,利用Fosmid文庫方法從SY8菌株中分離到一個17.5 kb的DNA序列,
6、覆蓋了完整的As(Ⅲ)氧化酶基因簇(aoxX-aoxS-aoxR和aoxA-aoxB-aoxC-aoxD),利用反向PCR方法從TS44菌株中克隆到一個14.6 kb的DNA序列,包含了完整的As(Ⅲ)氧化酶基因簇(arsD-arsA-aoxA-aoxB)和砷抗性基因簇(arsC1-arsR-arsC2-ACR3-arsH-DSP-GAPDH-MFS)。通過RT-PCR研究發(fā)現(xiàn):SY8的aoxXSR和aoxABCD分別共轉(zhuǎn)錄,屬于兩個操
7、縱子;TS44的兩個基因簇各自共轉(zhuǎn)錄,每個基因簇屬于一個操縱子;除了TS44的arsC1-arsR組成型表達外,上述所有基因在加入As(Ⅲ)、As(Ⅴ)或Sb(Ⅲ)誘導(dǎo)后表達水平均上調(diào)。生物信息學(xué)分析表明SY8 As(Ⅲ)氧化酶基因簇受雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控,但是與已報道的Agrobacterium tumefaciens5A具有較大的差異性,因此推測在SY8中存在一套新型細菌As(Ⅲ)感應(yīng)和信號傳導(dǎo)的雙組分調(diào)控模型。TS44的As(Ⅲ
8、)氧化酶基因簇結(jié)構(gòu)不典型,因為它只含有結(jié)構(gòu)基因并在其上游出現(xiàn)了arsDA,但是除了TS44外,在GenBank數(shù)據(jù)庫中沒有檢索到其它只含有結(jié)構(gòu)基因的As(Ⅲ)氧化酶基因簇。TS44的砷抗性基因簇的前5個基因被廣泛報道與砷抗性相關(guān),但是后3個基因則沒有被報道與砷抗性有關(guān)。上述三點分別揭示了SY8和TS44的3個砷解毒基因簇結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和新穎性。
本論文的結(jié)果在抗砷性微生物資源的開發(fā)、砷污染環(huán)境的微生物生態(tài)、細菌砷代謝和細菌砷
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