細(xì)菌的培養(yǎng)及鑒定思路

1、細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定思路,內(nèi)江市第一人民醫(yī)院 葉幫芬,標(biāo)本采集原則,1.及時采集微生物標(biāo)本作病原學(xué)檢查2.在抗菌藥物使用前采集標(biāo)本3.采樣時嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作4.標(biāo)本容器須無菌，但不得有消毒劑5.采樣后立即送檢6.送檢標(biāo)本應(yīng)注明來源和檢驗(yàn)?zāi)康?咳痰方法,病人先漱口，清潔口腔，去除表面的菌群 病人深咳，收集從下呼吸道咳出的痰液無痰可用3％～5％NaCl 5ml霧吸約5min導(dǎo)痰以清晨第二口痰為佳標(biāo)本采

2、集后放置時間不超過2小時,清潔中段尿液,盡量取早晨第一次尿液囑患者留取標(biāo)本的前一天晚上少飲水 女性病人收集標(biāo)本前用肥皂水沖洗外陰，再以滅菌清水沖洗尿道口排出幾毫升后，不停止尿流，采集中段尿男性病人翻轉(zhuǎn)包皮，清洗尿道口排出幾毫升后，不停止尿流,采集中段尿 采集標(biāo)本后立即送檢！,標(biāo)本接收原則,嚴(yán)格實(shí)行核對制度 ：包括姓名、性別、年齡、門診號

3、/住院號、病床號、標(biāo)本類型、容器、標(biāo)識、檢驗(yàn)?zāi)康牡?。所有拒收或退回?biāo)本均應(yīng)在登記本上登 記，登記內(nèi)容包括：病人姓名、病區(qū)、床號 送檢醫(yī)師、送檢項(xiàng)目、拒收(退回)原因、拒收時間、經(jīng)手人等,痰標(biāo)本涂片染色低倍鏡下分類,分級 白細(xì)胞（個） 上皮細(xì)胞（個） A >25 25

4、 25A、B兩種情況的痰適合做培養(yǎng)，C不合格，應(yīng)重新留標(biāo)本,哥倫比亞血平板—營養(yǎng)要求高的細(xì)菌巧克力平板—含V、X因子，主要培養(yǎng)嗜血桿菌、腦膜炎球菌和淋球菌用中國藍(lán)/麥康凱平板—G-桿菌用SS平板—沙門氏菌和志賀氏菌用M-H平板—細(xì)菌藥敏用TCBS平板—弧菌科細(xì)菌用沙包氏平板—真菌培養(yǎng)用真菌顯色平板—真菌培養(yǎng)用羅氏培養(yǎng)基—分枝桿菌用,常用的培養(yǎng)基種類和用途,接種工具,接種針和接種環(huán) ：由三部分組成

5、，即環(huán)（針）、金屬柄和絕緣 柄 接種針：用于穿刺接種細(xì)菌接種環(huán)：用于固體、液體培養(yǎng)基的細(xì)菌接種,器具：接種環(huán)（上）和接種針（下）,,操作原則：無菌操作（燒灼滅菌）,,,,,Aseptic area10-20cm,外焰,焰芯,內(nèi)焰,細(xì)菌接種的基本程序,滅菌接種環(huán),沾取標(biāo)本,接種,滅菌接種環(huán),,,,殺滅接種環(huán)沾染的細(xì)菌，以免污染標(biāo)本,殺滅接種環(huán)沾染的細(xì)菌，以免污染環(huán)境,細(xì)菌接種法,平板劃線接種法： ★目的：使混合的細(xì)菌呈單個分

6、散生長，形成單個菌落，以便獲得純菌。 ★方法：★分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本★連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本液體培養(yǎng)基接種法穿刺接種法 :用于觀察細(xì)菌動力斜面接種法 傾注培養(yǎng)法:用于細(xì)菌計(jì)數(shù),分區(qū)劃線法(3區(qū)),,,第一區(qū)劃線,,滅菌接種環(huán),,第二區(qū)劃線,滅菌接種環(huán),第三區(qū)劃線,滅菌接種環(huán),,,,,,連續(xù)劃線法,,,細(xì)菌培養(yǎng)法,一般培養(yǎng)（需氧培養(yǎng)）：★培養(yǎng)溫度：35℃（采用恒溫培養(yǎng)箱）★培養(yǎng)時間：18～24h

7、二氧化碳培養(yǎng)法：燭缸法、二氧化碳培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)法：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋、厭氧罐、皰肉培養(yǎng)法、硫乙醇酸鹽法等,細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象,菌落★定義：指單個細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上生長繁殖，形成單一肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)?！锞涮卣鳎捍笮　⑿螤?、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性★菌落類型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）菌苔：指多個菌落融合在一起形成的細(xì)菌堆積物。,菌 落,菌落與菌苔,菌落的三個類型：,1.光滑型菌

8、落（Smooth type Colony） ：又稱S型2.粗糙型菌落（Rough type Colony）：又稱R型3.粘液型菌落（Mucoid type Colony）又稱M型,2024/1/29,21,S型菌落,,R型菌落,,M型菌落,細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象,混濁沉淀：多見于鏈狀排列的細(xì)菌菌膜：多見于厭氧菌,細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：,,細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象,有鞭毛細(xì)菌：在培養(yǎng)基中沿穿刺線并向外擴(kuò)散生長，

9、穿刺線邊緣模糊。無鞭毛細(xì)菌：只沿穿刺線生長，穿刺線邊緣清晰。,細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象,有動力 現(xiàn)象,無動力 現(xiàn)象,斜面接種法,,,接種斜面后菌落生長示意圖（菌苔）,革蘭染色,原理：通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，，因此能把結(jié)晶紫

10、與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)復(fù)紅等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。,革蘭染色步驟,,涂片包括涂片、干燥、固定三步。 涂片 干燥

11、 固定,,,固定的目的：,使細(xì)菌的細(xì)胞凝固，使菌體與玻片粘得更牢固；可改變菌體對染料的通透性；加熱固定可殺死細(xì)菌，比較安全。,結(jié)晶紫 1’ 碘液 1’ 95%乙醇 30” 復(fù)紅1’ 沖洗 濾紙干燥 油鏡觀察,,,,沖洗,沖洗,沖洗,革蘭染色程序,初染,媒染,脫色,復(fù)染,,,紫色（G＋）,革蘭氏染色步驟示意圖,革蘭染色,,,甲菌,

12、,,,,,,,,,,乙菌,,,,,初染,結(jié)晶紫,媒染,碘液,脫色,乙醇,復(fù)染,稀釋復(fù)紅,紫色（G＋）,紅色（G-）,革蘭染色步驟示意圖,【結(jié)果】,細(xì)菌被染成紫色者，稱為革蘭陽性菌；而細(xì)菌染成紅色者，稱為革蘭陰性菌；,陽性菌——紫色（G+b) 陰性菌——紅色（G-b),,,,G+ 球菌,,顯微鏡下的桿菌,G-桿菌,Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells,革蘭染色注意事項(xiàng),標(biāo)本涂片不

13、宜太厚固定不宜過熱脫色不宜過度選用培養(yǎng)18--24小時菌齡的細(xì)菌為宜,抗酸染色,原理：分枝桿菌細(xì)胞壁含脂質(zhì)較多,其中主要成分為分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色時與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固,能抵抗酸性乙醇的脫色作用,因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色,達(dá)到染色目的。,抗酸染色步驟,,1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。 涂片 干燥

14、 固定,,,抗酸染色步驟,2、染色包括初染、脫色、復(fù)染三步。,石炭酸復(fù)紅維持 3-5’ 3%鹽酸酒精30 ’’ ~1’ 美藍(lán)復(fù)染1 ’ 沖洗 干燥 油鏡觀察,,,,,,,,,,,沖洗,沖洗,初染,脫色,復(fù)染,抗酸染色結(jié)果,抗酸菌呈紅色，常堆積成團(tuán)，排列無序，偶呈分枝狀生長。背景及非抗酸性細(xì)菌呈蘭色。,抗酸染色注意事項(xiàng),為防止交叉

15、感染，標(biāo)本先高壓滅菌后再涂片染色染色充分脫色時間寧長勿短在涂抹痰標(biāo)本時嚴(yán)禁對載玻片進(jìn)行加熱,臨床標(biāo)本培養(yǎng)基選擇,血： 血培養(yǎng)瓶中斷尿：血平板、mac平板腦脊液：血培養(yǎng)瓶、血平板、巧克力平板穿刺液：血培養(yǎng)瓶、血平板、巧克力平板、mac平板膽汁：血平板、巧克力平板、mac平板大便:.麥康凱、SS、血平板,臨床標(biāo)本培養(yǎng)基選擇,生殖道標(biāo)本根據(jù)臨床醫(yī)生所寫的檢驗(yàn)項(xiàng)目接種相應(yīng)的平板及操作： 淋

16、球菌培養(yǎng)接種淋球菌平板;念珠菌培養(yǎng)接種沙保羅培養(yǎng)基；支原體培養(yǎng)則按《支原體培養(yǎng)的操作規(guī)程》操作；作普通培養(yǎng)則接種血平板和巧克力平板,觀察細(xì)菌在平板上的生長現(xiàn)象,血平板：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性mac平板：大小、形狀、顏色、透明度、濕潤度、黏度巧克力平板：大小、形狀、顏色、透明度、濕潤度、黏度,無菌部位標(biāo)本,,,,2024/1/29,48,革蘭陰性菌 葡萄球菌,,痰培養(yǎng)真菌、鏈球菌菌落形態(tài)

17、,,細(xì)菌的初步分類,細(xì)菌的分離與純化：自血平板挑出待檢菌株的單菌落進(jìn)行初步的鑒定。如果混有雜菌，應(yīng)該重新轉(zhuǎn)種分純。染色與鏡檢： 首先通過革蘭氏染色確定基本的分類：（1）G+球菌（2）G-球菌（3）G-桿菌（4）G+桿菌。此外，如果鏡下發(fā)現(xiàn)革蘭氏染色陽性、橢圓形、有芽孢狀的較大菌體，可能是真菌。,細(xì)菌的初步分類,觸酶試驗(yàn) 主要用于G+球菌的分類。葡萄球菌屬（微球菌屬）：觸酶（+），鏈球菌屬及腸球菌：觸酶（-） 氧化發(fā)酵試驗(yàn)（O

18、/F試驗(yàn)） 根據(jù)細(xì)菌在無氧環(huán)境中能否利用碳源將細(xì)菌分為非發(fā)酵菌(O/F陰性)和發(fā)酵菌（O/F陽性）氧化酶試驗(yàn)： 腸桿菌的氧化酶（-），非發(fā)酵菌多數(shù)氧化酶（+），但嗜麥芽窄食單胞菌和不動桿菌的氧化酶（-）， 弧菌科氧化酶（+）,G-桿菌的鑒定途徑,G染色 G-b O/F試驗(yàn)和氧化酶（ox)試驗(yàn) OF（-）

19、 OF（+） OF（+） ox（+） ox（-） ox（+） 非發(fā)酵型細(xì)菌 腸桿菌科 弧菌科,G-桿菌ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng),腸桿菌科、 弧菌科 ID32E腸桿菌科鑒

20、定條 ATBG-5腸桿菌科藥敏試條非發(fā)酵菌 ID32GN非發(fā)酵菌鑒定條 ATBPSE5非發(fā)酵菌藥敏試條,2024/1/29,54,革蘭陰性鑒定及藥敏試條,,血清學(xué)試驗(yàn),腸道致病菌生化特征符合的前提下必須有血清學(xué)的試驗(yàn)作最后確認(rèn)： 1.志賀氏菌多價和單價凝集血清 2.沙門氏菌多價和單價凝集血清 3.致病性

21、大腸桿菌多價和單價凝結(jié)血清 4. 耶爾森氏菌凝集血清,G+球菌的鑒定途徑,1.首先根據(jù)菌落特點(diǎn)和革蘭氏染色判斷是否為G+球菌。2.根據(jù)觸酶結(jié)果判斷為葡萄球菌（微球菌屬）or鏈球菌（腸球菌）3.葡萄球菌屬：觸酶（+）鏈球菌屬及腸球菌：觸酶（-）,G+球菌的鑒定途徑,葡萄球菌屬：觸酶（+）、氧化酶（-）、 O-F試驗(yàn)：發(fā)酵型 微球菌屬：觸酶（+）、氧化酶（+

22、）、 O-F試驗(yàn)：氧化型,金黃色葡萄球菌,最重要的致病葡萄球菌血平板上菌落有明顯β溶血環(huán)，顏色呈金黃色、灰白色或檸檬色分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇血漿凝固酶和DNA酶陽性,,2024/1/29,60,葡萄球菌,,ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng),葡萄球菌： ID32STAPH葡萄球菌鑒定條 ATBSTAP

23、H5葡萄球菌藥敏試條,2024/1/29,62,葡萄球菌鑒定、藥敏試條,,鏈球菌鑒定途徑,鏈球菌屬:觸酶（-）、七葉苷（-）、 6.5%NaCl（-） 腸球菌：觸酶（-）、七葉苷（+）、 6.5%NaCl（+）,鏈球菌鑒定途徑,根據(jù)G染色和觸酶結(jié)果確定為鏈球菌，然后再根據(jù)細(xì)菌的溶血情況和菌落特點(diǎn)判斷鑒定途徑,鏈球菌鑒

24、定途徑,根據(jù)G染色和觸酶結(jié)果確定為鏈球菌，然后再根據(jù)細(xì)菌的溶血情況和菌落特點(diǎn)判斷鑒定途徑,,鏈球菌鑒定途徑,α溶血 Optochin R S

25、 + 膽汁七 葉苷 -- 肺炎鏈 球菌 D群鏈球菌 草綠色鏈球菌,,鏈球菌鑒定途徑,β溶血 桿菌肽 CAMP 膽汁七 葉苷 S +

26、 + A群鏈球菌 B群鏈球菌 D群鏈球菌 6.5%NaCl -- + 非腸球菌 腸球菌,,鏈球菌鑒

27、定途徑,γ溶血 膽汁七 葉苷 +

28、 -- D群鏈球菌 草綠色鏈球菌 - 6.5%NaCl +非腸球菌 腸球菌,ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng),鏈球菌： RapidID32STREP鏈球菌鑒定條 ATBSTREP5鏈球菌藥敏試條 腸球菌： RapidID32STREP鏈球菌鑒定條

29、 ATBEnteroc5腸球菌藥敏試條,G-桿菌的鑒定途徑,G染色 G-b O/F試驗(yàn)和氧化酶（ox)試驗(yàn) OF（-） OF（+） OF（+） ox（+） ox

30、（-） ox（+） 非發(fā)酵型細(xì)菌 腸桿菌科 弧菌科,ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng),腸桿菌科、 弧菌科 ID32E腸桿菌科鑒定條 ATBG-5腸桿菌科藥敏試條非發(fā)酵菌 ID32GN非發(fā)酵菌鑒定條

31、ATBPSE5非發(fā)酵菌藥敏試條,真菌的鑒定途徑,沙包氏培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基革蘭氏染色：陽性、橢圓形、有芽孢狀的較大菌體通過血清芽管形成試驗(yàn)鑒定出白念珠菌CSF標(biāo)本通過墨汁染色可以初步判斷為新型隱球菌,,,ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng),酵母樣真菌： ID32C酵母菌鑒定條 ATBFUNGUS3酵母菌藥敏條,嗜血桿菌的鑒定途徑,只能在營養(yǎng)條件高的巧克

32、力平板上生長，菌落為中等大小、圓形、灰白色、透明革蘭染色：G-小桿菌衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)就可以幫助初步鑒定,2024/1/29,79,嗜血桿菌,,,,ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng),嗜血桿菌： APINH嗜血桿菌鑒定條 ATBHAEMO嗜血桿菌藥敏試條,奈瑟氏菌屬鑒定,在血平板和巧克力平板上生長，mac上不生長血平板形成灰色、濕潤、透明或半透明、不溶血的菌落巧克力平板上形成圓形、灰藍(lán)色的似露滴狀菌落革蘭染色： G-雙

33、球菌，呈腎形或咖啡豆形，凹面相對氧化酶和觸酶都均為陽性,,奈瑟氏菌屬有11個種，臨床就淋病奈 菌和腦膜炎奈瑟菌 最為重要,奈瑟氏菌屬鑒定流程,菌落觀察：灰色、濕潤、透明或半透明、不溶血 涂片染色：G-雙球菌，呈腎形或咖啡豆?fàn)?

34、 氧化酶試驗(yàn)+ 觸酶+ +

35、 麥芽糖 -- 腦膜炎奈瑟菌 淋病奈瑟菌,莫拉菌有4個種，僅卡他莫拉菌對人類有致病性,莫拉菌屬,卡他莫拉菌鑒定,在血平板和巧克力平板上生長，mac上不生長血平板形成灰白色或紅棕色、不溶血的菌落，培養(yǎng)48小時，菌落表面干燥，接種環(huán)可推移整個菌落且不粘環(huán)革蘭染色：G-雙球菌，呈咖啡豆形氧化酶和觸酶都為陽性,卡他莫拉菌 鑒定流程,菌落觀察：

36、灰白色或紅棕色、光滑 、不溶血、干燥 涂片染色：G-雙球菌，呈腎形或咖啡豆?fàn)?氧化酶試驗(yàn)+ 觸酶+ + DNAM酶 --

37、 卡他莫拉菌 其他奈瑟氏菌,奈瑟氏菌屬與相似菌鑒別的關(guān)鍵性試驗(yàn),葡萄糖 麥芽糖 蔗糖 硝酸鹽還原 DNA酶淋病奈瑟菌 + -- -- -- --腦膜炎奈瑟菌 +

38、 + -- -- -- 卡他莫拉菌 -- -- -- + +,ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng),奈瑟氏菌屬和莫拉菌鑒定和藥敏試條同 嗜血桿菌,需氧G+b的鑒定途徑,根據(jù)抗酸染

39、色（A）將其分為： A+：分枝桿菌、奴卡氏菌 A- ：李斯特菌屬，芽胞桿菌屬、棒狀桿菌屬、乳酸桿菌屬、 丹毒絲菌屬等,需氧G+b的鑒定途徑,屬間鑒定，通過觸酶和動力試驗(yàn)加以初步確定 觸酶（+） + 動力 - 李斯特菌屬

40、 棒狀桿菌屬 芽胞桿菌屬,需氧G+b的鑒定途徑,屬間鑒定，通過觸酶和動力試驗(yàn)加以初步確定 觸酶（-） 動力（-） 乳酸桿菌屬 丹毒絲菌屬,棒狀桿菌屬,臨床上以白喉棒狀桿菌最為重要G+桿菌、菌體細(xì)長呈棒狀、無芽胞

41、、無鞭毛、多形性，有異染顆粒 普通培養(yǎng)基上不生長，血平板上呈灰白色似干駱狀菌落，無或有狹窄溶血環(huán)亞啼酸鉀血平板上形成黑色或灰黑色菌落觸酶（+）、動力（-）,李斯特菌屬,李斯特菌屬只有產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌對人和動物致病觸酶（+）、動力（+）G+小桿菌，4°C可生長血平板上形成較小、圓形、光滑而有狹窄ß溶血環(huán)的菌落與鏈球菌區(qū)別：觸酶（+）,丹毒絲菌屬,丹毒絲菌屬只有紅斑丹毒絲菌對人類致病,,紅斑丹毒絲菌 ：G

42、+小桿菌、多形性、分解Glu、乳糖 、H2S（+）、觸酶（-）、動力（-） 乳酸桿菌 ：G+細(xì)長桿菌、常呈鏈狀排列、磺胺藥物R、 青霉素S 、觸酶（-）、動力（-）,芽胞桿菌屬,枯草桿菌 炭疽桿菌,需氧G+b的鑒定途徑,分枝桿菌屬：G+細(xì)長或稍彎曲菌體，營養(yǎng)要求高，一般生長緩慢 ，抗酸染色陽性 奴卡氏菌 ：G+的分枝菌絲或斷裂成桿狀，抗酸染色弱陽性 ，菌落粗顆