口腔細菌的培養(yǎng)及應(yīng)用

1、口腔細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用,武漢大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 郭繼華,第一節(jié) 細胞培養(yǎng),一、 細胞培養(yǎng)的基本原理,細胞培養(yǎng)：模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在適當(dāng)?shù)臈l件下，使活體組織細胞在體外環(huán)境存活、生長增殖，并維持其結(jié)構(gòu)功能。,培養(yǎng)細胞的形態(tài)特點,貼壁型細胞： 必須貼附于支持物表面才能生長。大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞,按照培養(yǎng)細胞的主要形態(tài)，可分為幾大類型,成纖維細胞型胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞

2、質(zhì)突起，生長時呈放射狀、火焰狀、漩渦狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌細胞等等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。,上皮型細胞細胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜，生長時呈膜狀移動，起源于內(nèi)、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。,游走細胞型　　在支持物上呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活

3、躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。 多型細胞型　　有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。,懸浮型細胞： 于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面，見于某些癌細胞和血液淋巴細胞,培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長　　　 或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長 來自血，脾或骨髓 在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小細胞團 生存空間大，

4、提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，　　易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 觀察不方便,培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程,培養(yǎng)細胞生命期　　所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。,原代培養(yǎng)期：　　也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。細胞群是異質(zhì)的，也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存

5、性強。細胞獨立生存性差。初代培養(yǎng)細胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細胞和體內(nèi)細胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象。,傳代期：　　初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系。為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。反復(fù)傳代就有可能導(dǎo)致細胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細胞

6、增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。,衰退期：　　此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。在細胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細胞可能獲得永生性或惡性性。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系，也稱連續(xù)細胞系。無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲

7、不死性后，核型大多變成異倍體。細胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細胞也可能具有惡性性質(zhì)。細胞永生性和惡性性非同一性狀。,培養(yǎng)細胞一代生存期,所謂細胞“一代”一詞，系僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第n代細胞，即指該細胞系已傳代n次。在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：,潛伏期（游離期，貼壁期）對數(shù)生長期停止期（平

8、臺期）,潛伏期：　　細胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。,初代培養(yǎng)細胞貼附慢，可長達10～24小時或更多；連續(xù)細胞系和惡性細胞系快，10～30分鐘即可貼附。細胞貼附現(xiàn)象是一個非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程。支持物能影響細胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物

9、表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素，細胞表面蛋白等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細胞膜的表面，有的則來自培養(yǎng)基中的血清。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。,初代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約24～96小時或更長，連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6～24小時；細胞接種密度大時潛伏期短。當(dāng)細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標(biāo)志細胞已進入指數(shù)增生期。,,指數(shù)增生期：　　這是細胞增值最旺盛的階段

10、，細胞分裂相增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。一般以細胞分裂指數(shù)表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%～5%。,特點：　　是細胞增生最活躍、活力最旺盛的階段　培養(yǎng)物中細胞數(shù)量呈指數(shù)增長,細胞群體均一　是理想的實驗用細胞,在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細胞數(shù)量不斷增多

11、、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制。,細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細胞分裂停止。,停滯期：　　細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞

12、數(shù)量不再增加，故也稱平臺期。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。,培養(yǎng)細胞的體外生長環(huán)境,無污染環(huán)境,超凈臺,超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。,濾 器,壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣

13、電熱干燥箱：干熱消毒（160 ℃ ，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒 濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、 酶液等均采用濾過法除菌 超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒,基 質(zhì),玻璃基質(zhì)塑料飼養(yǎng)細胞生物性基質(zhì)處理培養(yǎng)表面金屬,氣體環(huán)境和氫離子濃度,Hepers 緩沖液,CO2 +H2O ← →H2CO3 ←

14、→H+ + HCO3-,CO2: 5%,液相環(huán)境,水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液,,天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。 成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié) 果的分析。 易發(fā)生支原體污染,合成培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類

15、和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。 成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。,人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖

16、，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。,血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分,無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，如激素、生長因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴展因子 等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。無血清細胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定

17、性，，減少了細胞污染，簡化了提純和鑒定各種細胞產(chǎn)物的程序。,溫度 滲透壓,二、 細胞培養(yǎng)的基本方法,無菌操作技術(shù),體外培養(yǎng)細胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。,培養(yǎng)前準(zhǔn)備 在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好

18、。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。,培養(yǎng)室的消毒 無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min?！┎僮饔镁呷缫埔浩?、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。,洗手和著裝 原則上

19、和外科手術(shù)相同。并于開始操作前要用75％酒精消毒手和前臂。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。,培養(yǎng)過程中的無菌操作 在無菌環(huán)境進行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。,進行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已

20、接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。,基本培養(yǎng)操作技術(shù),培養(yǎng)細胞的取材與分離,取材部位準(zhǔn)確嚴(yán)格無菌操作盡快培養(yǎng)減小損傷制備標(biāo)本,分散組織 機械分離法 消化分離法,培養(yǎng)細胞的純化,人工純化（酶消化法，機械刮除法，反復(fù) 貼壁法，克隆法等）自然純化,細胞的凍存與復(fù)蘇,所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速

21、率降至零下某一溫度，并在此溫度下對其長期保存的過程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。,低溫保護劑的應(yīng)用,在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰

22、晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。,凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融,當(dāng)細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。,常規(guī)細胞培養(yǎng)法,原代培養(yǎng) 取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條

23、件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng) 細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。,細胞培養(yǎng)的污染、檢測與控制,微生物污染,空氣、器材、操作、試劑、組織標(biāo)本,微生物污染的檢測,細菌和真菌的污染和檢測 肉眼直接觀察法 培養(yǎng)檢查法 顯微鏡觀察法,支原體的污染和檢測,造成支原體高污染率的原因： 　　1.支原體大小0.1－0.8 um，無細胞壁，可透過一般過濾膜（0

24、.22-0.45 um）； 　　2.支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化 ；　　3.過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式； 　　4.細胞流通間缺乏物品管理，造成實驗室間的相互污染； 　　5.研究或操作人員忽略污染問題； 6.已受污染的細胞； 7.已受污染的培養(yǎng)基、血清。,支原體之檢測：相差顯微鏡觀察法、電鏡法Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNA熒光染色法 PCR方法,微

25、生物污染的控制,抗生素除菌法加溫處理,化學(xué)污染 細胞交叉污染,第二節(jié) 口腔醫(yī)學(xué)中相關(guān)細胞培養(yǎng)及其特點,一、 牙齒相關(guān)細胞,牙髓細胞,培養(yǎng)中的細胞成分： 成纖維細胞 未分化的間充質(zhì)細胞,培養(yǎng)方法,取材,浸泡,修剪,鋪瓶,培養(yǎng),,,,,細胞形態(tài)特點,免疫組織化學(xué)染色,波形絲蛋白表達陽性角蛋白、神經(jīng)絲蛋白、結(jié)蛋白、膠質(zhì)細胞 原纖維酸性蛋白表達陰性,生長增殖

26、特點,成功率快速增殖期死亡,功能特點,堿性磷酸酶活性礦化現(xiàn)象對鈣調(diào)節(jié)因子的作用對細胞因子的反應(yīng)對氫氧化鈣、羥基磷灰石蓋髓劑的反應(yīng),牙周膜細胞,培養(yǎng)方法,取材,浸泡,修剪,鋪瓶,培養(yǎng),,,,,培養(yǎng)中的細胞成分： 成纖維細胞 未分化的間充質(zhì)細胞,細胞形態(tài)特點,免疫組織化學(xué)染色,波形絲蛋白表達陽性角蛋白、神經(jīng)絲蛋白、結(jié)蛋白、膠質(zhì)細胞 原纖維酸性蛋白表達陰性,生長增

27、殖特點,成功率快速增殖期死亡,功能特點,分泌功能礦化功能收縮功能附著能力再生能力,增殖分化影響因素,生長因子胰島素纖維粘連蛋白抗壞血酸羥基磷灰石,二、唾液腺細胞,細胞形態(tài)特點,腺泡上皮細胞導(dǎo)管上皮細胞肌上皮細胞,免疫組織化學(xué)染色,腺泡上皮細胞：角蛋白、淀粉酶、對氨基水楊酸、導(dǎo)管上皮膜、 前角蛋白、單克隆角蛋白、分泌成分陽性反應(yīng)導(dǎo)管上皮細胞：角蛋白、上皮膜蛋

28、白、磷酸酐酶抗體染色陽性反應(yīng)肌上皮細胞： 肌動蛋白、S－100蛋白、肌凝蛋白抗體染色陽性反應(yīng),功能特點,分泌功能,腺泡細胞：淀粉酶、PRP、唾液過氧化物酶、特異蛋白等腺泡上皮細胞：頂端分泌、基底及側(cè)膜分泌導(dǎo)管細胞：膠原肌上皮細胞：膠原,唾液腺細胞的增殖分化,基底潛能干細胞理論單細胞全能干細胞理論雙細胞亞全能干細胞理論,增殖分化功能影響因素,細胞因子激素細胞外基質(zhì)鈣離子,三、口腔粘膜細胞,培養(yǎng)方法,組織塊法酶消

29、化法,細胞形態(tài)特點,免疫組織化學(xué)染色,波形絲蛋白表達陰性多種角蛋白表達陽性,功能,分泌：膠原蛋白和非膠原蛋白 金屬蛋白酶,四、頜骨相關(guān)的硬組織細胞,破骨細胞,形態(tài)學(xué)特點組織化學(xué)染色特點功能,成骨細胞,形態(tài)學(xué)特點免疫組織化學(xué)染色特點功能：,成骨作用對破骨細胞的調(diào)節(jié)作用,軟骨細胞,形態(tài)學(xué)特點組織化學(xué)染色特點功能影響軟骨細胞功能分化的因素,五、口腔腫瘤細胞,培養(yǎng)腫瘤細胞生物學(xué)特性 腫

30、瘤細胞與體內(nèi)正常細胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內(nèi)的腫瘤細胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，其差異較小，但也并非完全相同。,形態(tài)和性狀 培養(yǎng)中癌細胞無光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細胞鏡下觀察比二倍體細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細胞表面的微絨毛多而細密，微絲走行不如正常細胞規(guī)則，可能與腫瘤細胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關(guān)。,生長增殖 腫瘤細胞在體

31、內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細胞增殖生長的因子，而癌細胞在低血清中（2％～5％）仍能生長。已證明腫瘤細胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長的現(xiàn)象，已成為檢測細胞惡變的一個指標(biāo)。癌細胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個細胞培養(yǎng)時，形成集落（克?。┑哪芰Ρ日＜毎麖姟Ａ硗獍┘毎鲋硵?shù)量增多擴展時，接觸抑制消除，細胞能相互重疊向三維

32、空間發(fā)展，形成堆積物。,永生性 永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細胞可無限傳代而不凋亡。體外培養(yǎng)中的腫瘤細胞系或細胞株都表現(xiàn)有這種性狀。,浸潤性 浸潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為，培養(yǎng)癌細胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時，能浸潤入其它組織細胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。,異質(zhì)性 所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤

33、體周邊區(qū)的細胞獲得血液供應(yīng)多，增殖旺盛，中心區(qū)有的細胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細胞稱干細胞（Stem Cells）、只有這些干細胞才是支持腫瘤生長的成分。,細胞遺傳 大多數(shù)腫瘤細胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細胞群常由多個細胞群組成，有干細胞系和數(shù)個亞系，并不斷進行著適應(yīng)性演變。,培養(yǎng)方法 腫瘤細胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底

34、物等幾個方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細胞培養(yǎng)與正常組織細胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。,口腔鱗癌細胞：舌鱗狀細胞癌系涎腺腫瘤細胞：人黏液表皮樣癌系 腺樣囊性癌系,來源生物學(xué)特性,,來源生物學(xué)特性,,來源生物學(xué)特性,,第三節(jié) 口腔組織工程與干細胞,一、 組織工程的基本原理,修復(fù)缺損器官的方法自體移植異體移植組織代用品,

35、組織工程的基本原理和方法 組織工程是應(yīng)用細胞生物學(xué)和工程學(xué)原理,將人體某部分的組織細胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進行人工培養(yǎng)繁殖,擴增,然后移植到人體內(nèi)所需要的部位,從而達到器官修復(fù)或再造的治療目的的一種技術(shù).,組織工程的核心問題是：建立由細胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體,優(yōu)點：形成具有生命力的活體組織用最少量的組織細胞修復(fù)大塊組織缺損任意塑形,組織工程的關(guān)鍵技術(shù): 組織構(gòu)成細胞的培養(yǎng) 生物組織是

36、由實質(zhì)細胞和間質(zhì)細胞構(gòu)成。對于組織工程來說，首先要求獲取所要培養(yǎng)組織的細胞。細胞可來源于自體細胞，這是一種較常規(guī)的選擇，可以避免機體的免疫排斥反應(yīng)，但是受到種類、數(shù)量、時間等限制。因此必須考慮其它方式來獲取細胞，如應(yīng)用治療性克隆技術(shù)從胚胎干細胞誘導(dǎo)分化成組織特異干細胞或應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得工程細胞。獲取細胞后，還要研究細胞擴增防老化技術(shù)及其機理，干細胞快速、規(guī)模擴增等問題。,生物材料及構(gòu)架制備 為了形成具有三維結(jié)構(gòu)的組織

37、，必須提供一個構(gòu)架，構(gòu)架選擇的聚合體必須有足夠的彈性提供細胞一個類似生命體的力學(xué)環(huán)境，充分多的孔隙允許培養(yǎng)液浸潤生長的組織，傳輸營養(yǎng)物質(zhì)和清除細胞代謝廢物，隨著組織的生長能夠自我降解，但是降解速度不能太快，要有足夠的時間保證細胞長進去，及時填補聚合體溶解留下的空隙。所以必須用多分支的、多孔滲水的聚合物材料制作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)架，常用的有聚羥基乙酸、聚乳酸類等生物材料。 其關(guān)鍵技術(shù)主要包括基體材料改性、表面修飾、表面活性組裝、降解速

38、率調(diào)控、三維構(gòu)架設(shè)計和制備等等。,良好的生物相容性生物降解性良好的表面活性具有多孔性,組織工程支架材料的要求：,生物組織工程化培養(yǎng)系統(tǒng)的研究 力學(xué)環(huán)境(微環(huán)境—應(yīng)力分布)是誘導(dǎo)、調(diào)控細胞功能分化，影響細胞能動運動、粘附、聚集以及細胞之間的相互作用，進而決定其生物圖式的構(gòu)成的重要因素。 另一方面，細胞的生長要求一定的化學(xué)微環(huán)境。在離體培養(yǎng)條件下，化學(xué)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持必須通過特殊設(shè)計的傳質(zhì)過程實現(xiàn)。而傳

39、質(zhì)過程總是和介質(zhì)的應(yīng)力分布耦合在一起的。因此，組織工程中的細胞／組織培養(yǎng)系統(tǒng)和生物化學(xué)工程中傳統(tǒng)的生物反應(yīng)器有質(zhì)的區(qū)別，它的研究涉及組織工程學(xué)的一些基本的科學(xué)問題，而它本身又是組織工程的關(guān)鍵技術(shù)之一。,二、 口腔干細胞研究,干細胞（Stem cell）即起源細胞。在細胞的分化過程中，細胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能力，最終衰老死亡。機體在發(fā)展適應(yīng)過程中為了彌補這一不足，保留了一部分未分化的原始細胞?！　　∫虼?，干細胞是

40、一類具有自我更新和分化潛能的細胞。,概念,全能干細胞多能干細胞單能干細胞,按分化潛能,按發(fā)育狀態(tài),胚胎干細胞成體干細胞,干細胞的分類,成體干細胞研究是干細胞研究中最激動人心的部分。它可以有效地防止組織排斥，可以避免倫理學(xué)、法律系方面的爭論。,成年動物的許多組織和器官，比如表皮和造血系統(tǒng)，具有修復(fù)和再生的能力。成體干細胞在其中起著關(guān)鍵的作用。在特定條件下，成體干細胞或者產(chǎn)生新的干細胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能細胞，從而使組