一節(jié)免疫細胞的分類與分離

1、免疫細胞的分離與檢測,第一節(jié) 免疫細胞的分類與分離,一、免疫細胞的種類與特征二、免疫細胞的分離技術(shù)三、細胞的凍存與復蘇,免疫細胞的特征,1、免疫細胞的形態(tài)學特征 理化性狀 生物學特性2、免疫細胞的膜分子特征 CD分子,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,免疫細胞的起源與分化,紅細胞 血小板 肥大細胞 中性粒細胞 巨噬細胞 樹突狀細胞 漿細胞 T細胞 NK細

2、胞,免疫細胞的分離技術(shù),1、密度梯度離心法2、黏附分離法3、熒光激活分離法4、磁性分離法5、其他分離法,密度梯度離心法,離心前,離心后,稀釋抗凝血,淋巴細胞分離液,血漿,單個核細胞,粒細胞,紅細胞,沉降速度 =,2r2（Q—Q0）,9 ? ?,,x g,Q =顆粒比重 Q0 =溶質(zhì)比重 r =顆粒半徑? = 形狀因子 = 顆粒摩擦系數(shù)/同體積球型顆粒摩擦系數(shù)? = 粘稠度 g = 相對

3、離心力,人類血液有形成分的平均密度與直徑,密度 直徑（?）血小板 1.04—1.06 淋巴細胞 1.06—1.08 8—10粒細胞 1.08—1.09 13紅細胞 1.09—1.10

4、 7.5,,,,黏附分離法,尼龍毛法貼壁法親和板法吸附柱法,,熒光激活分離法（FACS）,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,熒光檢測器,濾光片,透鏡,接物鏡,激光束,偏轉(zhuǎn)板,噴嘴,細胞收集管,流體護套,樣品,流式細胞儀,磁性分離法,磁鐵吸引法磁式細胞分類術(shù)法,MACS (陽性選擇法）,,,,,,N,S,MACS (陰性選擇法）,,,,,N,S,其他分離法,花環(huán)沉降法細胞活化克

5、隆法MHC分子四聚體法,抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù),細胞的凍存與復蘇,細胞凍存的原理與方法細胞復蘇的原理與方法,細胞凍存罐,第二節(jié) 免疫細胞膜分子的檢測,一、免疫細胞膜分子檢測的原理與類型二、免疫細胞膜分子的檢測方法,免疫細胞膜分子檢測的原理與類型,1、以抗體識別抗原2、以配體識別受體,免疫細胞膜分子的主要檢測方法,1、免疫標記檢測方法 熒光抗體法 酶免疫檢測法 免疫金銀染色法2

6、、補體依賴的細胞毒試驗（CDC）3、花環(huán)形成試驗,SmIg的熒光抗體檢測法,SmIg的酶免疫檢測法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,補體依賴的細胞毒試驗（CDC）,染料,補體,,,,E-花環(huán),T細胞,B細胞,花環(huán)形成細胞,綿羊紅細胞,EA-花環(huán),,EAC-花環(huán),,,,第三節(jié) 免疫細胞功能測定,一、轉(zhuǎn)化、增殖試驗二、細胞毒試驗三、抗體形成試驗四、細胞吞噬與殺傷試驗,1、淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗2、混合淋巴細胞培養(yǎng)

7、,轉(zhuǎn)化、增殖試驗,,,,,,,放射性測定,3H-TdR,絲裂原（抗原）刺激,淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗原理示意,1、T細胞介導的細胞毒試驗2、NK活性測定3、ADCC作用測定,細胞毒檢測試驗,,放射性測定,細胞毒試驗原理示意,,,,,,靶細胞,效應細胞,分離上清,1、直接溶血空斑試驗2、間接溶血空斑試驗3、SPA-SRBC溶血空斑試驗,抗體形成試驗,直接溶血空斑試驗,,,,,,,,,,,,,,,,間接溶血空斑試驗,,,,,,,,,

8、,,,,,,,,SPA-SRBC溶血空斑試驗,1、細胞吞噬功能試驗2、細胞殺菌功能試驗,細胞吞噬與殺傷功能試驗,,,吞噬百分率 =,吞有顆粒的吞噬細胞數(shù),計數(shù)的吞噬細胞數(shù),,吞噬指數(shù) =,吞噬細胞吞噬的總顆粒數(shù),計數(shù)的吞噬細胞數(shù),,NBT還原試驗,原理：,N-N-C + H+N=N-R-,,,,,,N-NH2C N=NH,,,,,四氮唑基（淡黃色）,甲月簪基（紫黑

9、色）,NBT還原試驗,方法：,1、抗凝血 + 硝基藍四氮唑（NBT），37。C孵育25min。2、推片染色、鏡檢。,正常值：,NBT陽性細胞 7.5-15%,第四節(jié) 免疫細胞凋亡測定,一、細胞凋亡的概念與原理二、細胞凋亡的檢測方法,細胞凋亡的概念與原理,1、細胞凋亡的概念2、細胞凋亡的原理3、細胞凋亡的特點,細胞凋亡（apoptosis）,細胞在內(nèi)源性基因調(diào)控下發(fā)生的主動死亡過程，也稱程序性死亡。,細胞凋亡的過程,凋亡

10、信號——凋亡受體——信號傳導——凋亡基因啟動——編碼程序性死亡蛋白——細胞結(jié)構(gòu)解體——細胞凋亡,細胞凋亡機制,細胞凋亡的特點,1、細胞皺縮2、染色質(zhì)邊集3、凋亡小體出現(xiàn),細胞凋亡,細胞凋亡的檢測方法,1、形態(tài)觀察法2、生化檢測法3、流式細胞儀檢測法,形態(tài)觀察法,普通光鏡檢測——HE染色 甲基綠-派諾寧染色熒光顯微鏡檢測——溴化丙錠染色透射電鏡檢測——

11、典型形態(tài)改變,生化檢測法,凝膠電泳法原位末端標記法二苯胺分光光度法,凝膠電泳法,原理：斷裂DNA在凝膠中呈梯形排列 （DNA ladder）方法：提取總DNA DNA凝膠電泳 觀察DNA ladder現(xiàn)象,原位末端標記法（TUNEL）,原理：利用標記的dUTP，在TdT作用 下結(jié)合DNA斷片的3’末端羥基，

12、 顯示斷鏈DNA，提示凋亡方法：制備組織切片 標記物結(jié)合 標記物顯色 鏡檢,二苯胺分光光度法,原理：細胞凋亡可產(chǎn)生低分子量DNA，通過超速離心可與細胞核的高分子量DNA分離，分別測定兩種DNA，即可得出凋亡百分率。方法：裂解細胞 13000g超速離心 分別提取DNA 使DNA顯色，測定

13、,凋亡百分率 =,上清液OD值,上清液OD值+沉淀OD值,,流式細胞儀法,原理：PI標記凋亡細胞，通過FACS可 顯示凋亡細胞的特征性亞二倍體 峰。并可經(jīng)計算分析得出凋亡百 分率。方法：制備細胞懸液 PI染色 FACS檢測,本章小結(jié),1、免疫細胞的類型與分離技術(shù)2、細胞的凍存與復蘇3、免疫細胞膜分子的檢測原