阮長(zhǎng)耿血小板的研究進(jìn)展

1、血小板的研究進(jìn)展,蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 江蘇省血液研究所阮長(zhǎng)耿,一、血小板黏附、活化在血栓形成中的重要性,在生理性止血及動(dòng)脈血栓形成過(guò)程中，血小板粘附到暴露的血管內(nèi)皮下基質(zhì)并發(fā)生血小板活化是血栓形成的起始階段，進(jìn)而產(chǎn)生血小板聚集和釋放反應(yīng)，最終導(dǎo)致血小板血栓形成。現(xiàn)狀：參與黏附的相關(guān)分子的結(jié)構(gòu)、信號(hào)傳導(dǎo)以及這些分子 缺陷所引起的臨床疾病和癥狀； 進(jìn)展：vWF-A1/GPIb?, vWF-A2/ADAMTS1

2、3, vWF-A3-膠原抗血栓藥物：抗GPIb/IX/V－vWF－膠原軸； 抗GPⅥ/α2β1－膠原軸制劑；,,,,,,Exposed collagen,platelet,血小板膠原受體,,高剪切力條件下血小板初期不穩(wěn)定粘附依賴(lài)GPIb/IX/V復(fù)合物和GPⅥ的協(xié)同作用黏附后的血小板活化由GPⅥ介導(dǎo)血小板牢固粘附則依賴(lài)GPIa/IIa和GPIIb/IIIa的共同作用活化的血小板

3、釋放ADP、 TXA2，進(jìn)一步加強(qiáng) 血小板粘附和聚集,血小板的黏附過(guò)程,Primary Platelet Adhesion Receptors,有關(guān)血小板膠原受體在血小板黏附及活化過(guò)程中的相對(duì)作用一直存在爭(zhēng)議。最近發(fā)現(xiàn)GPIb/IX/V與GPⅥ可發(fā)生免疫共沉淀，結(jié)合兩者有相似的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，故有人提出GPIb/IX/V與GPⅥ在血小板膜

4、上相互彼鄰，在功能上相互協(xié)同。,,GPVI缺乏患者的血小板聚集和釋放反應(yīng)圖,Moroi M等1989年報(bào)導(dǎo)一名GPVI缺乏患者有出血傾向，而膠原（2ug/ml)誘導(dǎo)的血小板聚集為3%（正常對(duì)照：50-75%）ATP不釋放。ADP和瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集和釋放正常。,Moroi M, et al . J Clin Invest, 1989;84:1440,Aggregation of platelets from ?2 deficie

5、nt mice in response to soluble collagen. Integrin 2-deficient mice develop normally, are fertile, and display no obvious anatomical defects—Homozygous 2-deficient mice are viable and show no striking phenotypical differe

6、ncewhen compared with their heterozygous and wild type littermates.,Holtkotter O,et al.J Biol Chem, 2002:277:10789,抗血小板藥物,,,藥物 作用環(huán)節(jié),第一代 阿司匹林 環(huán)氧酶抑制劑 臨床應(yīng)用

7、 Ticlopidine ADP活化抑制劑 臨床應(yīng)用第二代 Reopro GPIIb-IIIa受體抑制劑 臨床應(yīng)用第三代 JAQ1 GPVI（膠原）受體抑制劑 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) AjvW2, 6B4

8、 “vWF-GPIb”抑制劑 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 82D6A3 “vWF-膠原” 抑制劑 動(dòng)物實(shí)驗(yàn),,抗GPⅥ/α2β1－膠原軸制劑,抗GPIa/IIa抗體：15D7和6F1體外實(shí)驗(yàn)表面可抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集；抑制高剪切力條件下血小板與固定的纖維狀膠原表面的黏附抗GPⅥ單克隆抗體： JAQ1 9O12、6B12、11A12、

9、SZ118等體外實(shí)驗(yàn)中，JAQ1完全抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，對(duì)凝血酶和佛波酯誘導(dǎo)的聚集無(wú)影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，JAQ1抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集和促凝活性表達(dá)。 肺栓塞模型中，95%對(duì)照小鼠在栓塞誘發(fā)后5分鐘內(nèi)死亡，而經(jīng)JAQ1處理小鼠均存活。使用JAQ1后出血的副作用輕。,,血小板與膠原表面的有效黏附是血栓形成的必備條件之一，因而GPIb/IX/V-vWF-膠原軸和GPⅥ/α2β1-膠原軸為抗血小板粘附治療的主要靶點(diǎn)。,抗黏附

10、治療作用策略：,15D7,11A12,SZ118,,抗GPIb/IX/V－vWF－膠原軸,抗GPIb單克隆抗體: 6B4 (SZ2)在狒狒的Folts模型中，6B4 Fab片斷2 mg·kg－1注射。GPIb封閉率 69%；股動(dòng)脈CFR抑制率100%；瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率100%；血小板數(shù)、出血時(shí)間無(wú)明顯變化，PT、APTT正常。,Folts 模型,Reopro對(duì)CFRs發(fā)生的影響,,2.5ug/ml Reop

11、ro,,0.0 3.0 6.0 0.0 2.5,,,813-F(ab)2,Reopro,,0.0 3.0 6.0 0.0 2.5,813-F(ab)2 Reopro,*,*,*,*,0.01<P<0.05

12、,*,抗vWF A1區(qū)單抗AJW200 在狗冠狀動(dòng)脈Folts’實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校珹JW200 0.3mg·kg－1，冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓形成抑制率達(dá)96％，體外血小板聚集抑制率81%；血小板數(shù)無(wú)明顯變化，但出血時(shí)間有延長(zhǎng)（5～22分）。,Bar graph showing inhibitory effect of AJvW-2 on neointima formation 14 days after balloon injur

13、y. AJvW-2 was administered as a single bolus injection at doses of 0.6 mg/kg (n=11) and 1.8 mg/kg (n=10). *P<0.01 vs control (n=11).,Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000;20:2303-2308.,AJvW-2 抗血管內(nèi)膜增殖效應(yīng),活化血小板可釋放出多種活性物質(zhì)如PD

14、GF、PAF、CD40L、MIP-1α和P選擇素等，介導(dǎo)血管損傷部為的炎性反應(yīng)，出現(xiàn)炎性細(xì)胞遷移、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊的發(fā)展。 抗vWF A1區(qū)單抗AJvW-2 可使受損的豚鼠頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜/中層比下降65%，對(duì)血小板數(shù)、出血時(shí)間、PT、APTT無(wú)影響。 以上結(jié)果表明抑制血小板粘附可減少血小板活化及血小板來(lái)源的細(xì)胞因子釋放，減輕炎性反應(yīng)和細(xì)胞增殖，有助于延緩動(dòng)脈內(nèi)膜病變。,抗vWF A1區(qū)單

15、抗AJW200 AJW200人體實(shí)驗(yàn)（24例），AJW200 0.05 mg·kg－1，血漿vWF封閉率為62.4％；vWF：Rcof活性為34％±16％（對(duì)照116％±41％）；PFA-100血流停止時(shí)間為202±78秒（對(duì)照 80±19秒）；所有志愿者出血時(shí)間和vWF抗原水平均無(wú)顯著變化。,抗GPIb/IX/V－vWF－膠原軸,抗GPIb單克隆抗體: 6B4

16、在狒狒的Folts模型中，6B4 Fab片斷2 mg·kg－1注射。GPIb封閉率 69%；股動(dòng)脈CFR抑制率100%；瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率100%；血小板數(shù)、出血時(shí)間無(wú)明顯變化，PT、APTT正常。VWF A3區(qū)單克隆抗體 82D6A3： 在狒狒動(dòng)脈血栓形成實(shí)驗(yàn)中，82D6A3 0.3 mg·kg－1可完全抑制股動(dòng)脈血管內(nèi)血栓形成， vWF與膠原結(jié)合能力抑制96％；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血小板

17、數(shù)、凝血指標(biāo)、VWF水平和出血時(shí)間均無(wú)明顯改變。,抗血小板粘附藥物的優(yōu)點(diǎn),在動(dòng)脈內(nèi)高剪切力條件下，血小板有效粘附和血栓形成必需依賴(lài)膠原-vWF-GPIb軸，對(duì)此途徑的抑制可更為特異地防止動(dòng)脈內(nèi)的血栓形成，而對(duì)靜脈系統(tǒng)的影響小，出血副作用輕。血小板粘附后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和血小板活化則主要依賴(lài)膠原-GPVI軸，對(duì)此途徑的抑制即可在更早階段阻止血小板活化，進(jìn)而抑制血栓形成。在較早階段抑制了血小板與病變部位的粘附及血小板活化，可明顯減少血小板釋放

18、CD40, PDGF等細(xì)胞因子，能顯著減輕血管炎性反應(yīng)和細(xì)胞增殖，有助于延緩動(dòng)脈內(nèi)膜病變，減少再梗死的發(fā)生。,二、血栓性血小板減少性紫癜(TTP),五聯(lián)征：發(fā)熱、血小板減少性紫癜、微血管性溶血性貧血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、腎臟受累發(fā)病機(jī)制：vWF-cp質(zhì)或量異常(vWF-cp基因變異、抗 vWF-cp自身抗體)血管內(nèi)皮損傷（抗內(nèi)皮細(xì)胞自身抗體、細(xì)胞毒素）血小板活化凝血酶敏感蛋白1,ADAMTS-13 缺乏相關(guān)性TTP

19、發(fā)病機(jī)制模式圖,,Tsp1 repeat,vWF-cp結(jié)構(gòu)模式圖,vWF-cp結(jié)構(gòu)圖及基因突變位點(diǎn)：,,* 我所發(fā)現(xiàn)的新突變位點(diǎn),*,臨床表現(xiàn)： 見(jiàn)于任何年齡，大多數(shù)在15—50歲；女性多見(jiàn)。 ?出血：以皮膚粘膜出血為主，嚴(yán)重者可發(fā)生顱內(nèi)出血。 ?微血管病性溶血性貧血：黃疸，血紅蛋白尿。 ?神經(jīng)精神癥狀：意識(shí)紊亂、頭痛、失語(yǔ)、驚厥、視力障礙、譫妄及偏癱等；以一過(guò)性，反復(fù)性和多變性為特征。

20、 ?腎臟損害：蛋白尿、血尿、肌酐升高，腎功能衰竭。 ?發(fā)熱：熱型不一，體溫常達(dá)38℃～40.5℃。,,血常規(guī)、血管內(nèi)溶血相關(guān)檢查 vWF多聚體分析 vWF-cp活性測(cè)定 vWF-cp抗原測(cè)定 vWF-cp自身抗體測(cè)定 vWF-cp基因突變檢查 ADAMTS-13/FXI Complex ELISA,實(shí)驗(yàn)室檢查,vWF多聚體分析,SDS-PAGE加免疫印跡（Furlan方法）雙向免疫輻射計(jì)（Obe

21、rt方法）殘余膠原結(jié)合試驗(yàn)（Gerristsen方法）殘余瑞斯脫霉素輔因子活性試驗(yàn)(Bohm方法）特異性微小重組底物（GST-VWF73-H）用于vWF-cp活性檢測(cè),vWF-cp活性測(cè)定,ADAMTS13 抗原測(cè)定（ELISA）,ADAMTS13 自身抗體測(cè)定（ ELISA）,治療： 診斷明確或高度懷疑本病時(shí)應(yīng)盡早開(kāi)始治療。 1，血漿置換及輸注新鮮血漿 仍是目前最有效方法，60％－90％病例有效，血

22、漿置換量每天2－3升（20ml—30ml/Kg），嚴(yán)重者可增加至40ml—80ml/Kg。病情穩(wěn)定后繼續(xù)1－2周。 2，免疫抑制劑 長(zhǎng)春新堿每周1－2mg×4－6周； 或潑尼松1mg/kg，酌情增減。 3，抗血小板GPIIb/IIIa單抗可阻斷血小板聚集， 4，抗CD20抗體、免疫球蛋白、切脾對(duì)難治、復(fù)發(fā) 或存在自身抗體的TTP有效。,三、血小板血栓形成

23、調(diào)控因素,黏附、活化后的血小板從血流中募集/聚集血小板，形成穩(wěn)定的血小板血栓。 除已知的調(diào)控因素外，目前發(fā)現(xiàn)有多種新的調(diào)控途徑參與血小板血栓的穩(wěn)定過(guò)程。,,Brass L. ATVB 2004;24:989-991,Gas6的結(jié)構(gòu)及作用,Gas6 ( growth arrest-specific 6 )是一種維生素K依賴(lài)蛋白，結(jié)構(gòu)類(lèi)似蛋白S，分子量75kDa，存在于靜息血小板的α顆粒中。血小板活化后，Gas6被釋放至血小板

24、表面和液相介質(zhì)中。 體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證明Gas6具有促進(jìn)血小板活化作用，Gas6基因剔除或抗體抑制均可抑制血小板聚集及血栓形成。 Gas6受體為血小板膜表面蛋白Mer（Ax1,Tyro3)，兩者結(jié)合后，通過(guò)蛋白磷酸化途徑（涉及PI-3K）活化血小板。根據(jù)Gas6-Mer作用特點(diǎn)，其功能發(fā)揮主要在血栓形成后期，對(duì)血栓形成有促進(jìn)和穩(wěn)定作用。,Gas6受體knockout對(duì)血小板聚集功能的影響,Gas6受體

25、knockout對(duì)血小板伸展功能的影響,,,Gas6受體knockout對(duì)血栓形成功能的影響,TOPICS1. Blood Coagulation Mechanisms2. Platelet Physiology and Immunology3. Bleeding Disorders4. Venous Thromboembolism (Management of DVT, DVT in Asia and Wes

26、tern Countries)5. Atherothrombosis in Asia: Aspects Different from Western World6. Update on Anti-Platelet Therapy7. New Developments on Antithrombotic Drugs8. Chinese Herbal Medicine in Anti-Thrombotic T