發(fā)熱伴血小板減少綜合征研究進(jìn)展合肥

1、“發(fā)熱伴血小板減少綜合征”研究進(jìn)展,李德新中國(guó)CDC病毒病所,,2009-2010年， 在湖北、河南和山東等地一些丘陵、山區(qū)相繼出現(xiàn)病因不明癥狀類似的病人，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、消化道癥狀、血小板減少、白細(xì)胞減少及多臟器功能損傷等,少數(shù)重癥病例死亡。,臨床癥狀,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),70例確診病例出血表現(xiàn),鑒定新病毒,非序列依賴單引物擴(kuò)增(SISPA)技術(shù) 首批測(cè)定了576個(gè)克隆，發(fā)現(xiàn)14個(gè)布尼亞科病毒樣核酸序列，包括L片段、M片段和

2、S片段編碼區(qū)和非編碼區(qū)基因序列 用RACE等技術(shù)測(cè)定全基因組序列 布尼亞病毒科白蛉熱病毒屬的新病毒,病毒分離和形態(tài)學(xué)特征,SFTS病毒顆粒,病毒與患者血清的免疫反應(yīng),用Vero細(xì)胞從湖北、山東、河南等6省市SFTS患者標(biāo)本中分離到18株病毒，蜱中分離到3株，病毒與患者血清有特異性免疫反應(yīng)。具有布尼亞病毒形態(tài)特征,病毒形態(tài),新布尼亞病毒基因組特征,NSm ?,L、M和S片段基因遺傳進(jìn)化分析,與已知白蛉病毒屬病毒編碼氨基

3、酸差別顯著,系統(tǒng)發(fā)生分析,,實(shí)驗(yàn)室診斷方法,一、核酸檢測(cè) 熒光定量PCR 傳統(tǒng)PCR二、抗體檢測(cè) IgM(捕獲法ELISA、免疫層析、IFA) IgG(間接法ELISA、IFA) 總抗體(雙抗原夾心法ELISA)三、抗原檢測(cè),,,,L片段,M片段,傳統(tǒng)RT-PCR檢測(cè)患者標(biāo)本,Real-time PCR檢測(cè)新病毒核酸,L,疑似患者血清224 份，病毒核酸陽(yáng) 性率68.4%，檢

4、出天數(shù)：3-15天 200份疫區(qū)健康人血清標(biāo)本，病毒核酸均陰性 180份實(shí)驗(yàn)室血清庫(kù)健康人血清病毒核酸均陰性 148份確診其他疾病患者血清標(biāo)本，病毒核酸均陰性。,M,S,熒光定量PCR的臨床研究結(jié)果,陽(yáng)性組 陰性組 合 計(jì) 陽(yáng)性 147 0 147 陰性 2 354

5、 356 合計(jì) 149 354 503 靈敏度 98.66％ 特異度 100％,IFA檢查患者血清抗體,重組抗原制備,一、原核細(xì)胞表達(dá)、純化病毒核蛋白、NSs蛋白,SFTSV核蛋白在昆蟲細(xì)胞表達(dá),轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞（P3代）與病人血清反應(yīng),,制備抗原、抗體，建立檢測(cè)方法,檢測(cè)新布尼亞病毒抗體,雙抗原夾心ELISA法

6、,基于重組抗原的MacELISA,利用原核和真核表達(dá)體系，純化、制備病毒特異性抗原。獲得一批人源、鼠源抗新布尼亞病毒單克隆抗體，鼠、兔多克隆抗體。完成抗體修飾標(biāo)記和評(píng)價(jià)，建立了檢測(cè)病毒特異性IgM、IgG和總抗體的ELISA，IFA，F(xiàn)A，膠體金免疫層析法。建立和初步評(píng)價(jià)了檢測(cè)病毒中和性抗體的微量中和，空斑減少中和方法,……,病人雙份血清IgG抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或4倍以上升高,病人雙份血清中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或4倍以上升高,病毒抗原檢測(cè),單克隆抗體,采

7、用噬菌體表面展示技術(shù)，已經(jīng)獲得一批人源抗新布尼亞病毒單克隆抗體 制備了抗新布尼亞病毒核蛋白和包膜糖蛋白的鼠單克隆抗體,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,宿主和媒介,,一、從蜱中分離到數(shù)株新布尼亞病毒二、蜱病毒核酸檢出率較高三、從羊、狗血清中分離到病毒四、從羊、狗和牛血清中檢測(cè)到病毒核酸五、從羊、牛、狗和豬血清中檢出病毒抗體六、從嚙齒動(dòng)物中檢出病毒核酸和抗體,家畜抗體檢測(cè),一、鼠組織中SFTSV抗原二、鼠血清中SFT

8、SV抗體,嚙齒動(dòng)物感染調(diào)查,免疫熒光檢測(cè)鼠腦SFTSV抗原,人-人傳播,From a to f: Index Patient, ICU Doctor, Consultant Doctor, Younger Son, Older Son and Mortuary Beautician,* Samples collected in acute phase range from 1 -10 days after onset- Negtive

9、 + Weak positive +++ Positive,聚集性病例的病原學(xué)檢測(cè),Phylogenetic Analysis of SFTSV isolated from this cluster and other strains previously isolated in China,,,,L,M,S,,No./Total(%),*Medical care workers in ICU and close contacts

10、,動(dòng)物模型和發(fā)病機(jī)制,SFTS病毒分別經(jīng)不同途徑接種小鼠，接種后第三天出現(xiàn)出血小板計(jì)數(shù)減少、白細(xì)胞減少。 不同地區(qū)、不同患者標(biāo)本分離的SFTS病毒接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)類似結(jié)果，但是程度有差別 攻擊后動(dòng)物一些器官出現(xiàn)病理變化，一些器官發(fā)現(xiàn)病毒抗原。,動(dòng)物模型和發(fā)病機(jī)制,接種SFTSV,0 1 3 5 7 10 14 21

11、 28 (Day),在不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠進(jìn)行分析: 血小板和血細(xì)胞計(jì)數(shù); 血液病毒載量; 血清抗體免疫應(yīng)答反應(yīng); 脾細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng); 病理學(xué)特征性改變.,動(dòng)物血液和組織中病毒載量,病毒攻擊后的血小板減少和白細(xì)胞減少,動(dòng)物的細(xì)胞和體液免疫,(A,D) PBS 對(duì)照組; (B,C) 病毒感染組, 20x; (E,F) 病毒感染組, 40x.,SFTSV感染小鼠的病理改變,腎: 腎小球系膜細(xì)胞增生，腎

12、小球充血，未見炎細(xì)胞侵潤(rùn)。肝: 肝細(xì)胞變性和炎性細(xì)胞聚集;脾: 病毒染色陽(yáng)性細(xì)胞為巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞。,Pathologic features in the early phase of the infection,Spleen: Lymphocyte depletion (Day 1) Increased megakaryocyte (Day 3),Pathologic features in the

13、 late phase of the infection,Kidney: Glomerular hypercellularity, mesangial thickening, congestion, absence of inflammation(Day 14)Liver: Hepatocyte degeneration and necrosis (Day 14),Macrophage marker: F4/80.,脾臟和腎臟巨噬

14、細(xì)胞增加,脾臟巨噬細(xì)胞病毒抗原陽(yáng)性,Anti-N protein monoclonal antibody (Green). Macrophage marker: F4/80 (Red).,Virus positive monocytes located in red pulp of spleen,20X 20x,40x,Increased clearanc

15、e of platelet by splenic macrophage,Platelet marker: CD62P (Green fluorescence and IHC). Macrophage marker: F4/80 (Red fluorescence).,其他研究,一、生物學(xué)特性；疫苗研究基礎(chǔ)二、檢測(cè)方法；懸浮芯片三、發(fā)病機(jī)制；免疫應(yīng)答四、反向遺傳：NSs功能,理化因素對(duì)SFTSV的影響,空斑形成和PRNT,

16、重組蛋白的表達(dá)和純化,懸浮芯片檢測(cè)10種病毒IgG抗體,細(xì)胞因子的改變,,從cDNA拯救感染性重組病毒,5 Plasmids co-transfection,M: 21.17 L: 20.90 S: 18.96,Infection of Vero,M: 12.34 L: 12.32 S: 13.93,Infection of Vero,Ctrl,rSFTSV,wt SFTSV,SFTSV反向遺傳研