二株棉花立枯病拮抗菌的篩選與鑒定

1、二株棉花立枯病拮抗菌的篩選與鑒定二株棉花立枯病拮抗菌的篩選與鑒定杜志兵，杜秉海，姚良同，黃偉紅，丁延芹1（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東，泰安271018）摘要摘要:從棉花根際分離了1277個細菌分離物，以棉花立枯病病原真菌立枯絲核菌（RhizoctoniasolaniKuhn）為靶標(biāo)菌，通過平板對峙法獲得25個具有拮抗性能的分離物，其中MH1和MH25具有很強的拮抗性能，且拮抗性能穩(wěn)定，具有較好的生防潛力。經(jīng)過形態(tài)觀察、生理生化特征分

2、析及16SrDNA堿基序列測定和同源性分析，將MH1鑒定為短短芽孢桿菌（Brevibacillusbrevis），MH25鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。MH1和MH25的16SrDNA堿基序列已在GenBank中注冊，登陸號分別為：EF488102，EF488103。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞:棉花根際拮抗立枯病鑒定ISOLATIONIDENTIFICATIONOFANTAGONISTICBACTERIAINHIBITING

3、AGAINSTPANTHOGENICFUNGIOFCOTTONRHIZOSPHEREDUZhibingDINGYanqinYAOLiangtongHuangWeihongDUBinghai(DepartmentofmicrobiologyCollegeoflifescienceShongAgriculturalUniversityTaian271018China)Abstract:Twentyfivestrainsofantagonis

4、ticbacteriascreenedfrom1277isolatesofcottonrhizosperehaveinhibitioneffectagainstRhizoctoniasolabniKuhn.Basedontheresultsofmphologicacteristicsphysiologicalbiochemicalpropertiesphylogeicanalysisof16SrDNAMH1wasidentifiedas

5、BrevibacillusbrevisMH25wasidentifiedasBacillussubtilis.Thesequencesof16SrDNAobtainedinthisstudyhavebeenregisteredatGenBankdatabasetheaccessionnumberrespectivelyareEF4488102EF4488103.KeyWds:cottonrhizosphereRhizoctoniasol

6、aniantagonisticidentification棉花立枯病是由立枯絲核菌（RhizoctoniasolaniKuhn）引起的，是世界各產(chǎn)棉區(qū)分布廣泛，危害嚴(yán)重的病害，我國主要棉區(qū)都有發(fā)生，其中以黃河流域為重，現(xiàn)在采用合理輪作、選用抗病品種[1]、施用化學(xué)農(nóng)藥等措施防治棉花立枯病的發(fā)生，但是輪作和篩選抗病品種周期長，使用化學(xué)農(nóng)藥不能從根本上防治棉花立枯病，又帶來了環(huán)境污染。而生物防治的方法可以減少化學(xué)農(nóng)藥帶來的環(huán)境污染，又解決了

7、抗病棉種篩選周期長，抗病單一的缺點，是一種行之有效的方法；此方法既限制了有害微生物生長又增加了根際有益微生物的數(shù)量。近年來雖然有棉花立枯病原菌拮抗菌的相關(guān)報道[234]，但是存在著拮抗菌難以在棉花根際長期定殖的問題。本實驗從棉花根際分離并篩選的拮抗菌有利于其在棉花根際的定殖。拮抗菌的應(yīng)用還可以有效的促進植物的生長。本實驗從高河周大廟、馬集新莊、雞黍李固堆、濟寧、金鄉(xiāng)、濟寧農(nóng)科院的農(nóng)田中采集棉花根際土，篩選棉花立枯病的拮抗細菌，獲得具有很

8、好生防應(yīng)用潛力的拮抗菌株2株，其中MH1被鑒定為短短芽孢桿菌（Brevibacillusbrevis），MH25被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。1通訊作者：Tel:865388242908Email:dingyq6885@基金項目：山東省優(yōu)秀中青年科研獎勵基金（2006BS06012）作者簡介：杜志兵(1980~)男在讀碩士，研究方向為分子微生物學(xué)Email:duzhibing331@Comment[MS1]:

9、照片中菌體未產(chǎn)芽孢，需注明培養(yǎng)時間Ⅸ金鄉(xiāng)試驗田8311.20%Ⅹ金鄉(xiāng)試驗田5323.77%Ⅺ濟寧農(nóng)科院7522.67%Ⅻ濟寧農(nóng)科院7011.43%ⅩⅢ濟寧農(nóng)科院7411.35%從13個棉花根際土樣中得到1277個細菌分離物，初篩獲得有拮抗作用的細菌分離物25個（表1）。從表1看出，不同地域的13個棉花根際土中獲得的拮抗分離物的比率相差較小，這是因為取樣時棉花的生長期相同，決定了其根際微環(huán)境的一致性。將初篩獲得的25個有拮抗作用的細菌分離

10、物進行復(fù)篩，結(jié)果表明MH1和MH25抑菌帶直徑可達到3050㎜，經(jīng)多次實驗驗證其抑菌效果較為穩(wěn)定。2.2MH1和MH25的鑒定的鑒定MH1的菌體大小為0.50~0.551.05~1.10μm，G，兼性厭氧，短桿狀，產(chǎn)芽孢且孢囊膨大，在LB平板上培養(yǎng)24h后，菌落為無色，粘稠厚重，半透明，表面濕潤光滑，邊緣規(guī)則。MH25的菌體大小為0.7~1.02.05~2.10μm，G，兼性厭氧，桿狀，產(chǎn)芽孢，在LB平板上培養(yǎng)24h后，菌落乳白色，粘稠

11、，不透明，表面濕潤有褶皺，邊緣不規(guī)則。2.3生理生化特征生理生化特征表3生理生化特征Table3acteristicofphysiologybiochemistry特征acteristicsMH1B.brevisMH25B.subtilisMH1MH2555圖１MH1和MH25對立枯絲核菌的作用Fig1effectofstrainsMH1MH25onRhizoctoniasolaniKuhnMH1MH25圖2MH1和MH25的光學(xué)顯微鏡