棉花根際拮抗菌的篩選、鑒定及枯草芽孢桿菌MH25 Iturin A操縱子克隆.pdf

1、從金鄉(xiāng)、濟(jì)寧農(nóng)科院農(nóng)田中采集13個(gè)棉花根際土壤樣品，通過平板培養(yǎng)法，獲得1277個(gè)細(xì)菌分離物。以立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)為指示菌，采用平板對峙法初篩獲得對棉花立枯病具有拮抗作用的25個(gè)細(xì)菌分離物，其中MH1和MH25對棉花立枯病抑制效果明顯，具有作為生防制劑的潛力。 通過形態(tài)觀察、生理生化測定和16S rDNA測序分析，將MH1鑒定為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)，M

2、H25鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。 根據(jù)已報(bào)導(dǎo)的芽孢桿菌非核糖體合成抗生素的操縱子保守序列，設(shè)計(jì)兼并性引物TGD(5’-TWYCGIACIGGIGAYYKIGKICG-3’)和LGG(5’-AWIGARKSICCICCISSRIMRAARAA-3’)。通過PCR擴(kuò)增，得到818bp的DNA片斷。將序列測定結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST，選擇同源性較高的Bacillus subtilis RB14的It

3、urinA操縱子序列、Bacillus subtilisAU195的Bacillomycin D操縱子序列、Bacillus subtilis ATCC6633的Mycosubtin操縱子序列，分析其同源序列，分別設(shè)計(jì)14對和6對引物，相鄰片斷之間有不同長度的重疊序列。擴(kuò)增之后，選擇適當(dāng)大小的PCR產(chǎn)物，連接載體進(jìn)行測序，在NCBI中比對，確定是與抗生素相關(guān)的序列之后，根據(jù)重疊序列將其拼接，最終獲得了38845bp長度的DNA片斷。

4、 利用DNAman軟件，對獲得的片斷進(jìn)行分析，初步結(jié)果該片斷含有四個(gè)ORF，將其四個(gè)ORF分別與Bacillus subtilis RB14的IturinA操縱子序列的四個(gè)對應(yīng)ORF序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)ORF1與ituD相似性為99％。ORF2與ituA相似性為98.70％，ORF3與ituB相似性為98.99％，ORF4與ituC相似性為99.48％，每個(gè)ORF中又含有不同功能的結(jié)構(gòu)域，在ORF1上游序列中，發(fā)現(xiàn)有TATACACA-

5、16bp-TAGGAT序列，推測其可能是該操縱子的啟動(dòng)子，但是其與σA-10和-35(TTGACA-17bp-TATAAAT)有差別。 采用同源重組的方法，敲除Bacillus subtilis MH25 ituB基因的色氨酸腺苷酸化區(qū)域。首先以Bacillus subtilis MH25基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出Tyr區(qū)域的DNA片斷，將其連接到載體pMD18-T，構(gòu)建質(zhì)粒pMDT，然后用限制性內(nèi)切酶Sal I和Xba