基因工程詳解課件2015版醫(yī)學(xué)、生物學(xué)博士課程用

1、基 因 工 程 （GENETIC ENGINEERING）,基 因 工 程 （GENETIC ENGINEERING）,,,第一節(jié) 概 述,基因工程技術(shù)的定義,用人工方法，提取或制備某種細(xì)胞的某種基因，在體外把它和一種載體連接構(gòu)造雜種DNA分子，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，讓其復(fù)制與表達(dá)，以改變受體細(xì)胞的某些性狀或產(chǎn)生人們所需的產(chǎn)物的工程技術(shù)。,克?。╟lone）,指來(lái)自于同一始祖的一群相同分子、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物（常被稱(chēng)為副本或拷貝）。

2、獲取大量單一拷貝的過(guò)程稱(chēng)為克隆化（cloning）,也稱(chēng)無(wú)性繁殖。 細(xì)胞克隆、個(gè)體克隆、分子克隆,細(xì)胞克?。╟ell clone）,細(xì)胞克?。╟lone）:由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)無(wú)性繁殖而形成的細(xì)胞群體。,個(gè)體克?。∣rganism cloning ）,個(gè)體克隆（Organism cloning）：即是利用生物技術(shù)由無(wú)性生殖產(chǎn)生與原個(gè)體有完全相同基因組之后代的過(guò)程?？寺≡趫@藝學(xué)上是指通過(guò)營(yíng)養(yǎng)生殖產(chǎn)生的單一植株的后代。很多植物都是通過(guò)克

3、隆這樣的無(wú)性生殖方式從單一植株獲得大量的子代個(gè)體。 克隆一個(gè)生物體意味著創(chuàng)造一個(gè)與原先的生物體具有完全一樣的遺傳信息的新生物體。目前，現(xiàn)代生物學(xué)背景下，這通常包括了體細(xì)胞核移植。,分子克隆(molecular cloning),分子克隆（molecular cloning）:指建立單一的重組DNA的無(wú)性系的過(guò)程。即指在體外制備DNA，切割拼接成重組DNA，通過(guò)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，使重組DNA在受體細(xì)胞中擴(kuò)增復(fù)制，形成單一DNA

4、分子大量拷貝的過(guò)程。意指由一個(gè)祖先分子復(fù)制生成的和祖先分子完全相同的分子群體。,Recombinant DNA Technology,In 1980 he shared half of the Nobel Prize for Chemistry with the team of Walter Gilbert and Frederick Sanger. All three were recognized for their importa

5、nt contributions to basic research in nucleic acids,Paul Berg,An American biochemist who assisted Herbert Boyer in the creation of the first recombinant DNA organism, and won the 1986 Nobel Prize for his work with Rita L

6、evi-Montalcini in discovering cell growth factors.,Stanley Cohen,克隆技術(shù)的應(yīng)用前景,1.改良動(dòng)物品種 2.挽救瀕臨滅絕的物種 3.培植人體皮膚 4.研制名貴藥品 5.培育人體器官,,第二節(jié) 工具酶,分子克隆技術(shù)中，DNA的切割、重組、修飾及合成都涉及一系列酶促反應(yīng)，催化這些反應(yīng)的酶是進(jìn)行DNA操作的

7、基本工具，故稱(chēng)為工具酶。,,一、限制酶,（一）限制酶的定義,限制酶(restriction enzyme): 一類(lèi)專(zhuān)門(mén)切割DNA的酶。是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并與其特異結(jié)合，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)核酸內(nèi)切酶。 “Restriction endonucleases are bacteria enzyme which cut (hydrolyze)DNA into defin

8、ed and reproducible fragments . In bacteria they form part of the restriction—modification defense mechanism against foreign DNA. They are basic gene cloning tools .”,,阿爾伯(Wemer Arber 1929～)瑞士生物學(xué)家，內(nèi)森斯(Danien Nathans 192

9、8～1999)美國(guó)微生物學(xué)家，史密斯(Hamilton O．Smith 1931～)美國(guó)微生物學(xué)家，由于限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其在分子遺傳學(xué)中的應(yīng)用，為遺傳工程的產(chǎn)生拉開(kāi)了序幕而獲得1978年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。,（二）限制酶的發(fā)現(xiàn),大腸桿菌的限制—修飾系統(tǒng)中，該系統(tǒng)由兩種酶組成： 限制酶（分解和識(shí)別DNA的酶） 修飾酶（改變堿基結(jié)構(gòu)，免遭限制酶分解） 

10、 甲基化修飾Am/Cm 兩種酶作用于同一DNA的相同部位,,,細(xì)菌的限制—修飾系統(tǒng),限制酶 1.防御外源性DNA入侵。 2.構(gòu)成細(xì)菌種屬和菌株之間交叉繁殖屏障，但

11、又允許外源DNA有某些遺漏，利于物種進(jìn)化。 3.基因工程重要的工具酶。甲基化酶 1.保護(hù)自身DNA不受限制酶切割（限制）。 2.影響DNA分子構(gòu)象，利于基因表達(dá)調(diào)控。甲基化酶:DAM methylase (DNA adenine methylase) is an enzyme that adds a methyl group to the adenine of the sequence 5'-GA

12、TC-3' in newly synthesized DNAdcm  -  DNA cytosine methylase,（三）限制酶的分類(lèi)與命名,1.分類(lèi)（根據(jù)酶的組成、所需輔助因子及裂解DNA的方式）： Ⅰ型R.E 復(fù)合酶：核酸內(nèi)切酶、甲基化酶（修飾）、ATPase 識(shí)別序列: 特異性識(shí)別15bp 切割特點(diǎn): 識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)不一致產(chǎn)生片段較大、識(shí)別

13、后,要移動(dòng)100-1000bp切割。 Ⅲ型R.E M.W和亞基組成類(lèi)似Ⅰ類(lèi)R.E，作用方式同 I 型。 Ⅱ型R.E 分子內(nèi)部切割、特異性強(qiáng)、切割序列可知且固定。,2、限制酶命名的原則,（1）以該菌株的屬名的第一個(gè)字母及種名的頭兩個(gè)字母組成三個(gè)斜體字母的略語(yǔ)表示（2）同一種細(xì)菌若有不同菌株，則在屬名種名后再加上株名（3）若一個(gè)菌株中有幾種酶時(shí)，以羅馬字加以區(qū)分（4）同一屬細(xì)菌種名頭兩個(gè)

14、字母完全相同，其中一個(gè)菌的酶可改用詞頭后的另一個(gè)字母來(lái)代替,,,第一個(gè)字母 該酶來(lái)源的細(xì)菌屬名 大寫(xiě)英文字母 第二、第三個(gè)字母 該細(xì)菌的種名 小寫(xiě)英文字母 第四個(gè)字母 代表株名 羅馬數(shù)字 同株、不同酶發(fā)現(xiàn)的先后次序 屬

15、 名 + 種 名 + 株 名 + 序號(hào) （大.斜） (小.斜) (大/小.正) (正) E- Escherichia H- Haemophilus （EcoR I）co- coli （Hin d Ⅲ

16、）in- influenzae R- RY13 d- Rd I- 該株首次分離 Ⅲ- 該株第3次分離,,限制酶命名舉例：,（四）Ⅱ型限制酶的特性,1、各種限制酶具有專(zhuān)一的識(shí)別與切割序列： Sau3AI EcoR

17、I PstⅠ SmaⅠ5 ′GATC GAATTC CTGCAG CCCGGG 3′3′ CTAG CTTAAG GACGTC GGGCCC 5′,Sau3AI EcoRI

18、 PstⅠ HgaⅠ5 ′GATC GAATTC CTGCAG GACGC 3′3′ CTAG CTTAAG GACGTC CTGCG 5′,2、識(shí)別堿基對(duì)數(shù)目一般為： 4～6 堿基對(duì)，少數(shù)識(shí)別序列為8個(gè)或8個(gè)以上堿基對(duì)。,3、識(shí)

19、別序列大多為二重對(duì)稱(chēng)： 具有回文結(jié)構(gòu)（palindrom）。 Sau3AI EcoRI PstⅠ SmaⅠ5 ′GATC GAATTC CTGCAG CCCGGG 3′3′ CTAG CTTAAG

20、 GACGTC GGGCCC 5′,4、多數(shù)限制酶的切割位點(diǎn)就在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)，但少數(shù)限制酶的切割位點(diǎn)不在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)，而在識(shí)別位點(diǎn)的旁側(cè)。如HgaⅠ的識(shí)別位點(diǎn)是GACGC（5/10），切割位點(diǎn)在兩條DNA鏈上分別在距識(shí)別位點(diǎn)5個(gè)和10個(gè)核苷酸處。 Sau3AI EcoRI PstⅠ HgaⅠ5 ′GATC

21、 GAATTC CTGCAG GACGC 3′3′ CTAG CTTAAG GACGTC CTGCG 5′,5、有的識(shí)別序列中存在簡(jiǎn)并序列（有的核苷酸位點(diǎn)可以不同 ）。 簡(jiǎn)并序列： GTYRAC

22、 Y=C/T R=G/A YR=CG/CA/TG/TA ∴ HindⅡ可識(shí)別4個(gè)特定序列,6、限制酶的切割方式有兩種：,(1)識(shí)別序列內(nèi)兩條鏈上交錯(cuò)切割，產(chǎn)生單鏈突出的粘性末端(2)對(duì)稱(chēng)處同時(shí)切斷DNA的兩條鏈，產(chǎn)生平端DNA

23、片段,7、限制酶的切割產(chǎn)生三種不同末端,切割的結(jié)果：產(chǎn)生三種不同的末端 平末端— blunt end 5′突出— 5′- protruding （cohesive end ） 3′ 突出— 3′ - protruding （overhang tail） 切割的化學(xué)本質(zhì)：磷酸二酯鍵的斷裂, 形成含5′— P和3′—OH

24、 末端的兩個(gè)DNA片段。 對(duì)一特定的DNA而言，識(shí)別序列堿基對(duì)少的，則切點(diǎn)數(shù)多，產(chǎn)生的片段小。,,8、同功異源酶（isoschizomers）,同裂酶(isoschizomer)：又稱(chēng)異源同工酶，是指來(lái)源不同，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，切割DNA后產(chǎn)生相同末端的一類(lèi)限制酶。 例如：HhaⅠ和CtoⅠ的識(shí)別序列和切點(diǎn)都是相同的。 5′－GCGC－3′

25、3′－CGCG－5′,,,,9、同尾（裂）酶 有些限制性?xún)?nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同類(lèi)型的粘性末端。,,,,,BamHⅠ,BglⅡ,,+,+,,10、限制酶易失活，需注意酶活力的保存。,二、限制性作圖,標(biāo)明限制性?xún)?nèi)切核酸酶在DNA分子上的限制位點(diǎn)數(shù)目、限制片段大小及其排列順序的圖譜稱(chēng)為DNA的物理圖譜,又稱(chēng)限制性圖譜。,制作圖譜時(shí)注意以下3點(diǎn)：1、選擇在DNA鏈上切點(diǎn)在20個(gè)左右的酶，避免選擇

26、產(chǎn)生雙重帶的限制酶。2、DNA分子大小與物理圖譜的精確性有直接的關(guān)系。3、電泳時(shí)盡可能測(cè)定各片段的相對(duì)分子質(zhì)量。,組建物理圖譜需遵循的原則,1、瓊脂糖凝膠上的DNA片段用英文大寫(xiě)字母表示,從A起始,表示片段號(hào)由大到小。2、片段數(shù)超過(guò)26個(gè)字母,用小寫(xiě)字母連續(xù)排列。3、共移動(dòng)的片段,分別用不同的字母表示,如FGH等,而不用F1、F2和F3。4、環(huán)狀DNA的物理圖譜需找一個(gè)零點(diǎn),將整個(gè)DNA分為100等份,每等份為一個(gè)圖距單位。

27、5、片段順序的閱讀規(guī)定為:環(huán)狀圖譜按順時(shí)針?lè)较?線(xiàn)狀物理圖譜從左到右閱讀。,多種限制酶消化法作圖,用幾種限制酶分別或同時(shí)消化目的DNA、電泳分離、求出各片段的大小,然后推導(dǎo)出限制性圖譜的一種方法,注意:1、消化必須徹底。2、完全消化時(shí),DNA片段以等摩爾數(shù)存在,帶的強(qiáng)度與片段的長(zhǎng)度和含量成正比。3、限制性片段長(zhǎng)度的總和應(yīng)等于DNA分子的總長(zhǎng)度。4、DNA片段的數(shù)量與酶切次數(shù)有關(guān)。,限制酶部分消化法作圖,首先以某個(gè)酶對(duì)DNA進(jìn)行完

28、全消化,水解產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳分離,測(cè)定各片段的相對(duì)分子質(zhì)量。另外將此DNA用同一種酶部分消化,由于水解程度參差不齊,部分水解的電泳條帶多于完全水解的電泳條帶,部分水解片段相互存在重疊現(xiàn)象,部分水解片段的相對(duì)分子質(zhì)量等于兩個(gè)或兩個(gè)以上完全水解片段之和。根據(jù)兩類(lèi)消化中片段大小的關(guān)系和交錯(cuò)重疊現(xiàn)象,找出各片段的鄰近位置,排出它們的順序,得到某DNA的物理圖譜。,例如:用AvaⅡ消化一個(gè)18.1kb線(xiàn)狀DNA,完全消化得8個(gè)片段:,A(4.6k

29、b) 、B(4.0kb) 、C(3.3kb) 、D(2.5kb) E(2.0kb) 、F(1.0kb) 、G(0.5kb) 、H(0.2kb),部分消化得14個(gè)片段:,6.6kb、6.5kb、5.3kb、4.6kb、4.2kb、4.0kb、3.8kb 3.5kb、3.3kb、2.5kb、1.0kb、0.7kb、0.5kb、0.2kb,排除共有片段剩7個(gè)片段:,6.6kb、6.5kb、5.3kb、4.2kb、3.8kb、3.5kb、0.7

30、kb,,,,,,,,部分消化的大片段等于完全消化的幾個(gè)小片段之和:,6.6kb＝4.6＋2 (A＋E) 6.5kb＝4.0＋2.5(B+D) 5.3kb＝3.3＋2 (C+E) 3.8kb＝3.3＋0.5(C+G) 0.7kb＝0.5+0.2(G+H),4.2kb=4.0+0.2(B+H)或=2.5+1.0+0.5+0.2(D+F+G+H),3.5kb=2.5+1.0(D+F)或=2.0+1.0+0.5(E+

31、F+G)或=3.3+0.2(C+H),以上述結(jié)果為基礎(chǔ), 組建線(xiàn)性DNA的物理圖譜如下:,,,,,,,,,,4.6,,,2.0,3.3,0.5,0.2,1.0,2.5,4.0,末端標(biāo)記法作圖,末端標(biāo)記法實(shí)質(zhì)是部分消化法,即用一個(gè)酶部分消化DNA 之前,首先進(jìn)行DNA 的5′端和(或)3′末端標(biāo)記,然后對(duì)末端標(biāo)記的DNA進(jìn)行部分消化,凝膠電泳分離DNA、轉(zhuǎn)膜、放射自顯影。根據(jù)部分消化,完全消化和放射自顯影結(jié)果構(gòu)建DNA的物理圖譜。,,,,

32、基因組物理圖譜:,作圖的基本方法:,自上而下作圖(top-down mapping),自下而上作圖(bottom-up mapping),,,,作圖的基本方法:,自上而下作圖(top-down mapping),Not Ⅰ,Hind Ⅲ,,自下而上作圖(bottom-up mapping),三、DNA連接酶,DNA連接酶（DNA Ligase） T4 DNA連接酶 催化一雙鏈DNA3’-OH端與另一雙鏈DNA的5

33、’端磷酸根形成3’，5’- 磷酸二酯鍵，使具有相同粘性末端或平端的DNA末端連接起來(lái)。,T4 DNA連接酶（T4 DNA Ligase）,,,四、DNA聚合酶,1.依賴(lài)DNA的DNA聚合酶(DNA Polymerase),以單鏈DNA（SS DNA）為模板合成DNA的酶 E·Coli DNA聚合酶Ⅰ Klenow 片段 T7噬菌體DNA聚合酶

34、 T4噬菌體DNA聚合酶 耐熱DNA聚合酶,,,（1） E·Coli DNA聚合酶Ⅰ 一條多肽鏈組成, MW:109 kDa, 含Zn2+ 三種活性: 5′ 3′ DNA聚合酶 5′ 3′ 核酸外切酶

35、3′ 5′ 核酸外切酶 用途： 1、切口平移標(biāo)記DNA探針 2、對(duì)DNA的3′尾進(jìn)行末端標(biāo)記 3、合成cDNA第二鏈,,,,,,（2） Klenow 片段 枯草桿菌蛋白酶裂解E .Coli 聚合酶 I產(chǎn)生兩個(gè)片段，大片段的分子量76kD，又稱(chēng)Klenow 片段。 兩種活性

36、： 5′ 3′DNA聚合酶 3′ 5′外切酶活性  用途：1. 填平5′突出的粘端（補(bǔ)平3’端）， 3′————5′ 3′—————5′ 5′——3′ 5′——-

37、-------- 3′ 2．3’末端標(biāo)記（填平） 3．合成cDNA第二鏈 4. DNA序列分析,,,,,(3)耐熱DNA聚合酶：在PCR反應(yīng)中，DNA聚合酶是最關(guān)鍵的因素之一。PCR發(fā)明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它們因?qū)岬姆€(wěn)定性差而未得到廣泛應(yīng)用。直到耐熱的DNA聚合酶

38、(Taq DNA polymerase) 應(yīng)用于PCR反應(yīng)，才使這一技術(shù)得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。,1）TaqDNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在75-80℃具有最高的聚合酶活性。75-80℃每個(gè)酶分子每秒可延伸約150個(gè)核苷酸，70℃時(shí)延伸速度在60個(gè)核苷酸/秒以上。55℃時(shí)為22個(gè)核苷酸/秒；37℃和22℃時(shí)分別為1.5個(gè)和0.25個(gè)核苷酸/秒。溫度超過(guò)80℃時(shí)，合成速度明顯下降，可能與引物和模板結(jié)合穩(wěn)定性遭到破壞有關(guān)。

39、,Taq DNA聚合酶沒(méi)有3′→5′外切酶活性。沒(méi)有校正功能的。Taq DNA聚合酶具有類(lèi)似未端轉(zhuǎn)移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3′-OH端。,2）Tth DNA聚合酶,在95 0C半衰期為20分鐘，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，可簡(jiǎn)化RT-PCR。但不具3??5?外切酶活性，沒(méi)有校對(duì)功能，催化聚合反應(yīng)的錯(cuò)誤摻入率為1/500,3）Vent DNA聚合酶,該酶在1000C時(shí)半衰期達(dá)95分鐘，97.50C時(shí)半衰期長(zhǎng)達(dá)130分鐘，其擴(kuò)增產(chǎn)物的

40、長(zhǎng)度可達(dá)10-13kb。Vent DNA聚合酶具有3??5?外切酶活性，具有校對(duì)功能，錯(cuò)誤摻入率為1/31000，忠實(shí)性比TaqDNA聚合酶提高5?10倍。,4）Pfu DNA聚合酶,此酶耐熱性極好，在97.50C半衰期大于3小時(shí)，具有3??5?外切酶活性，催化DNA合成的忠實(shí)性比Taq DNA聚合酶高12倍。,2、依賴(lài)RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）,逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase ） 依賴(lài)于RNA的DNA

41、聚合酶，以RNA為模板合成DNA，合成方向?yàn)?’ 3’，無(wú) 3’ 5’核酸外切酶的活性。還兼有RNaseH活性，可使DNA：RNA雜合體中的mRNA水解。商品化產(chǎn)品： AML — 鳥(niǎo)類(lèi)成髓細(xì)胞白血病病毒顆粒中的RTase純化而得。★   MML — Moloney小鼠白血病病毒顆粒制備而得 rMML—基因工程制品。,,,3、不依賴(lài)模板的DNA聚合酶,末端轉(zhuǎn)移酶（末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移

42、酶）（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT） 功能：在M2+ 離子存在下，將脫氧核苷酸 （dNTP）加到DNA的3’-OH上 用途：主要用于探針標(biāo)記,用于在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行連接。,末端轉(zhuǎn)移酶的催化活性,,,五、RNA聚合酶,大腸桿菌RNA聚合酶,噬菌體RNA聚合酶,合成能力強(qiáng),轉(zhuǎn)錄高效快速,對(duì)啟動(dòng)子具有高度特異性,(

43、一)依賴(lài)DNA的RNA聚合酶,,作用:,1、用于標(biāo)記RNA探針,用于DNA或RNA序列的同源性分析,2、用于分析RNA或DNA末端,用于基因組DNA的序列測(cè)定和研究前體RNA的剪接,3、轉(zhuǎn)錄物可用于體外翻譯,加入放射線(xiàn)標(biāo)記的氨基酸合成放射線(xiàn)純的蛋白質(zhì),,,(二)不依賴(lài)DNA的RNA聚合酶,poly(A)聚合酶:以ATP為前體分子,催化AMP摻入至RNA游離的3′羥基端,作用:1、用α-32PATP標(biāo)記RNA的3′末端2、克隆缺少p

44、oly(A)尾的RNA。用poly(A)聚合酶加尾,oligo(dT)作為引物合成互補(bǔ)DNA。,,六、核糖核酸酶,用于RNA測(cè)序,RNA作圖及RNA定量。包括:,核糖核酸酶A核糖核酸酶H核糖核酸酶T1,,核糖核酸酶A,來(lái)源于牛胰,特異性水解RNA的內(nèi)切核糖核酸酶,作用:,1、對(duì)RNA定量和作圖,與RNA酶T1聯(lián)合使用,2、降解DNA制備物中的RNA分子,,3、RNA測(cè)序,去除DNA∶RNA雜交體中的未雜交的RNA區(qū),,核糖核酸酶H,

45、來(lái)自大腸桿菌的內(nèi)切酶,特異水解RNA∶DNA雜交體中RNA的磷酸二酯鍵,產(chǎn)生末端為3′羥基和5′磷酸的產(chǎn)物,不降解單鏈或雙鏈的DNA或RNA。,作用: 降解cDNA第一鏈合成時(shí)產(chǎn)生的RNA∶DNA雙鏈體中的mRNA分子,以利于雙鏈互補(bǔ)DNA的合成。,,核糖核酸酶T1,來(lái)源于米曲霉的內(nèi)切酶,特異地作用于鳥(niǎo)嘌呤核苷酸3′端磷酸并切割與相鄰核苷酸相連的磷酸二酯鍵,作用:1、在核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)中,對(duì)RNA進(jìn)行定量和作圖2、RNA測(cè)序

46、3、去除DNA∶RNA雜交體中未雜交的RNA區(qū),七、其他DNA修飾酶,,（一）堿性磷酸酶,堿性磷酸酶（alkaline phosphatase） 功能：能除去DNA或RNA 5’-端的磷酸基團(tuán) 用途：制備載體時(shí)，用該酶處理后，可防止載體自身 環(huán)化，提高重組效率。,外源基因克隆入 質(zhì)粒載體的過(guò)程,（二）T4多核苷酸激酶,催化兩種反應(yīng)： 正向

47、反應(yīng)：將ATP的γ-磷酸直接轉(zhuǎn)移到去磷酸化的DNA 5?-OH末端，這種反應(yīng)被稱(chēng)為正向反應(yīng)。 交換反應(yīng)：在過(guò)量ATP存在下，T4多核苷酸激酶將磷酸化DNA的5?端磷酸轉(zhuǎn)移給ADP,然后DNA從γ-P32_ATP中獲得放射性同位素標(biāo)記的γ-磷酸而重新磷酸化。可標(biāo)記DNA的5?-末端，可使缺失5?-P末端的DNA發(fā)生磷酸化作用。,T4多核苷酸激酶的活性,T4多核苷酸激酶的交換活性,（三）SI核酸酶,水解單鏈核酸，在基因工程，用于去

48、除DNA突出單鏈尾，打開(kāi)雙鏈cDNA合成期間形成的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。,SI核酸酶的活性,SI核酸酶的活性,第三節(jié) 載體（Vector）,一、定義：攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA 一個(gè)理想的載體應(yīng)具備以下幾個(gè)條件：（1）具有自主復(fù)制能力，以保證重組DNA分子在受體細(xì)胞內(nèi)得到擴(kuò)增。（2）分子量小，小分子的DNA制備時(shí)不易損傷，小分子DNA限制酶的切點(diǎn)少。（3）有較多的拷貝數(shù)，便于分離提純。（4）有一個(gè)或多個(gè)篩選標(biāo)記，能給寄

49、主（受體）細(xì)胞提供可選擇的標(biāo)記：如抗藥性，營(yíng)養(yǎng)缺陷型或顯色表型等，以利于篩選。 （5）具有多克隆位點(diǎn)，便于目的基因片段與載體連接。 (6)具有較高的遺傳穩(wěn)定性。,二、載體的分類(lèi),功能分類(lèi)： 克隆載體 表達(dá)載體組成元件的來(lái)源分類(lèi): 質(zhì)粒（plasmid）載體 噬菌體載體：如λ噬菌體載體、M13噬菌體載體 雜合載體 (如粘粒cosmid) 病毒性載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺

50、病毒載體等 人工染色體載體,,,載體的種類(lèi)和特征,三、克隆載體（cloning vector）,（一）克隆載體的功能：用來(lái)克隆和擴(kuò)增DNA片段 （目的基因）的載體具備條件：（a）必須是一個(gè)復(fù)制子，能在受體細(xì)胞中復(fù)制。 復(fù)制起點(diǎn) Ori 復(fù)制區(qū) 復(fù)制終點(diǎn)

51、 term （b）帶有抗藥性基因 Tet r：編碼膜蛋白，阻止Tet進(jìn)入細(xì)胞 Amp r：β-內(nèi)酰胺環(huán)水解酶。 Kan r： Kan～ P , neo～ p Cam r：氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶,,,,（C）具有多克隆位點(diǎn)（multiple cloning sits，MCS ） 載體上含有的

52、一個(gè)人工合成的DNA片段，其上含有數(shù)個(gè)單一酶切位點(diǎn)，是外源DNA的插入部位具備條件： 是載體中的一段堿基序列，由數(shù)個(gè)酶切位點(diǎn)組成。這些位點(diǎn)在載體上都是單一位點(diǎn)（d）可導(dǎo)入受體細(xì)胞,（二）常用克隆載體,質(zhì)粒（plasmid）載體 是獨(dú)立于許多細(xì)菌及某些真核細(xì)胞染色體外共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA分子（covalant closed circular,cccDNA），能獨(dú)立復(fù)制的最小遺傳單位。一般大小約106～108D，可

53、自身復(fù)制和表達(dá)，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標(biāo)記的抗藥性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過(guò)適當(dāng)改選后便可成為良好的載體。  作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當(dāng)改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。,1、質(zhì)粒的概念,,質(zhì)粒（plasmid） 是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA 分子。大小約為 數(shù)千堿基對(duì)。常 有1 ～ 3個(gè)抗藥 性基因，以利于 篩選。,2.質(zhì)粒載體必須具備的基本條件 (1) 、具有復(fù)制起點(diǎn)；

54、 自我增值的基本條件，一般具一個(gè)復(fù)制子。 (2) 、具有抗菌素抗性； 理想的質(zhì)粒載體具有兩種抗菌素抗性基因。 (3) 、具有若干限制酶切單一位點(diǎn)（CMS）； (4) 、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。 低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片斷 后仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞同時(shí)低分子量的質(zhì)粒對(duì)限制酶具有多重識(shí)別位點(diǎn)的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基

55、因,3.pBR322質(zhì)粒載體 “P”表示是一種質(zhì)粒； “BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個(gè)字母“F.Bolivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示實(shí)驗(yàn)編號(hào)。,pBR322質(zhì)粒,有兩個(gè)抗藥性基因，每個(gè)抗性基因中均含有單克隆位點(diǎn)，外源DNA插入后使相應(yīng)的抗性基因失活，宿主細(xì)胞失去相應(yīng)的抗藥性，不能在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，這一現(xiàn)象稱(chēng)為插入失活。,質(zhì)粒pBR322的抗性基因篩選示意圖,pBR322的結(jié)構(gòu)來(lái)源,pBR3

56、22質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)： 1、具有較小的分子量； 它的分子量為4363bp?？寺≥d體的分子量大小不要超過(guò)10kb。 2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。 pBR322 DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識(shí)別位點(diǎn)。其中7種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致tetr 基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基

57、因有單一的識(shí)別位點(diǎn)，,3、具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增之后每個(gè)細(xì)胞中可積累1000～3000個(gè)拷貝。,4. pUC質(zhì)粒載體 人們應(yīng)用多克隆位點(diǎn)技術(shù)，在pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5’-端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ’基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。,一種典型的pUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個(gè)部分： 1、來(lái)自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）； 2、氨芐青霉素抗性基因（am

58、pr ）,但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不在含有原來(lái)的核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別位點(diǎn)。 3、大腸桿菌β-半乳糖基因（lacZ）的啟動(dòng)子及編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱(chēng)之為lacZ’基因； 4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。,pUC18/19質(zhì)粒,有一個(gè)抗性基因，可用來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。 有一個(gè)lacZ基因片段，編碼β-半乳糖苷酶氨基端的一個(gè)片段（α）片段，某些

59、改造的宿主細(xì)胞可表達(dá)β-半乳糖苷酶的羧基端片段，質(zhì)粒和宿主細(xì)胞共表達(dá)時(shí)才具有β-半乳糖苷酶的活性，可使生色底物X-gal降解產(chǎn)生蘭色的化合物，這種現(xiàn)象稱(chēng)α-互補(bǔ)。,pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)第一， 具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù); 僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點(diǎn)；在操作過(guò)程中復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變?cè)斐闪嘶騬op的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個(gè)細(xì)胞500～700個(gè)拷貝。第二，適用

60、于組織化學(xué)檢測(cè)重組體； 具有來(lái)自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的α-肽鏈可參與α- 互補(bǔ)作用，用Xgal顯色對(duì)重組子進(jìn)行鑒定，而pBR322質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。 第三，具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段． 方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。,質(zhì)粒pBR322,質(zhì)粒pUC,5、穿梭質(zhì)粒載體（ shuttle plasmid vector ） 是指一類(lèi)由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起

61、點(diǎn)和選擇記號(hào)，因而可在兩種不同的寄主細(xì)胞存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。,例如：大腸桿菌-分支桿菌穿梭質(zhì)粒；大腸桿菌-酵母菌穿梭質(zhì)粒等。重組DNA的操作在大腸桿菌中進(jìn)行，然后轉(zhuǎn)入分支桿菌和酵母中表達(dá)。,6、質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問(wèn)題1、質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類(lèi)型 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性：主要指由轉(zhuǎn)位和重組作用所引起的質(zhì)粒DNA的重排與缺失。 分離的不穩(wěn)定性：在細(xì)胞分裂過(guò)程中，有一個(gè)子細(xì)胞沒(méi)有獲得質(zhì)粒DNA拷貝，并最終增值成為無(wú)質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群

62、體。,結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性 DNA的缺失、插入和重排是造成質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的原因。 1、質(zhì)粒的自發(fā)缺失：同向重復(fù)短序列之間的同源重組。 2、寄主染色體及質(zhì)粒載體上的IS因子或轉(zhuǎn)位因子也會(huì)引起結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。,分離的不穩(wěn)定性 細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)生的質(zhì)粒不平均的分配，也是導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定性的重要原因，將這種起因于質(zhì)粒的缺陷性分配所造成的質(zhì)粒的丟失現(xiàn)象，叫作質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性。,要使質(zhì)粒能夠

63、穩(wěn)定的遺傳，必須保證平均每個(gè)世代質(zhì)粒最少?gòu)?fù)制一次；并且，細(xì)胞分裂過(guò)程中，質(zhì)粒復(fù)制的拷貝必須分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去。主動(dòng)分配：a.平均分配機(jī)理：使每個(gè)子細(xì)胞剛好獲得一半數(shù)目的質(zhì)?？截恇.配對(duì)位點(diǎn)分配機(jī)理：只有一半數(shù)目的質(zhì)粒呈主動(dòng)分配，其余是隨機(jī)分配的。隨機(jī)分配：細(xì)胞分裂過(guò)程中質(zhì)?？截悢?shù)在兩個(gè)子細(xì)胞之間是隨機(jī)分配的。,影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素： 1、新陳代謝負(fù)荷對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)。 質(zhì)粒載體會(huì)加重寄主細(xì)胞

64、的代謝負(fù)荷； 外源克隆基因的產(chǎn)物對(duì)寄主細(xì)胞的毒害作用。 2、拷貝數(shù)差度對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響。 差度：不同細(xì)胞個(gè)體之間的質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)的差 異程度，可影響質(zhì)粒載體丟失的速率。 差度越大穩(wěn)定性越差；差度越小穩(wěn)定性越高。,3、寄主重組體系對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng) 在野生型的大腸桿菌細(xì)胞中，質(zhì)粒重組的重要結(jié)果是形成質(zhì)粒寡聚體，它也是造成質(zhì)粒載體不穩(wěn)定的原因之一。

65、質(zhì)粒DNA分子之間的重組頻率； 含質(zhì)粒寡聚體細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。 影響質(zhì)粒重組的突變也會(huì)影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。,噬菌體載體（Bacteriophage，簡(jiǎn)稱(chēng)phage）,1.噬菌體的溶菌生命周期噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期只具有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。烈性噬菌體溶菌生長(zhǎng)的基本過(guò)程：1、吸附 吸附到位于感染細(xì)胞表面的特殊接受器上2、注入 噬菌體DNA穿過(guò)細(xì)胞壁注入寄主細(xì)胞3、轉(zhuǎn)變 被感染

66、的細(xì)胞成為制造噬菌體顆粒的場(chǎng)所4、合成 大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì)5、組裝 包裝了DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒6、釋放 合成的子代噬菌體顆粒從寄主細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái),2.噬菌體的溶源生命周期溶源生長(zhǎng)周期： 是指在感染過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生出子代 噬菌體顆粒，噬菌體的DNA是整合到 寄主細(xì)胞染色體DNA上，成為它的一 個(gè)組成部分。

67、 現(xiàn)知道只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期,溫和噬菌體：既能進(jìn)入溶菌生命周期又能進(jìn)入溶 源生命周期。溶源性細(xì)菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細(xì)菌溶源化： 用溫和噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)物使之形成溶 源性細(xì)菌的過(guò)程整合： 噬菌體的DNA是被包容在寄主細(xì)胞染色體 DNA中原噬菌體：在溶源細(xì)菌內(nèi)存在的整合的或非整合的 噬菌

68、體超感染免疫性：溶源性細(xì)菌不能夠被頭一次感染并 使之溶源化的同種噬菌體再感染。,3、λ噬菌體載體,(1)λ phage生活周期和基因組結(jié)構(gòu),48.5 kb in lengthLinear or circular genome (cos ends),溶菌階段 (復(fù)制和釋放),溶源階段 (整合到寄主染色體上),,A W B C D E F Z U V G H M L K I J