2016現(xiàn)代組織化學(xué)技術(shù)-組織化學(xué)

1、現(xiàn)代組織化學(xué)技術(shù),組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué),1．掌握組織化學(xué)技術(shù)的基本概念2．熟悉組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)標(biāo)本的制備方法及過程3．掌握酶組織化學(xué)的基本原理4．熟悉高碘酸Schiff（PAS）反應(yīng)、過氧化物酶、酸性磷酸酶鉛法的基本原理,學(xué)習(xí)要求,1. 什么是組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)？,------介于細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)之間的邊緣科學(xué),------對組織與細(xì)胞的化學(xué)成分或者酶活性進(jìn)行定性、定位和定量的研究。常

2、統(tǒng)稱為“組織化學(xué)”,------在保持組織或細(xì)胞基本不改變其生活狀態(tài)時(shí)的微細(xì)結(jié)構(gòu)的條件下，利用某些特異性的反應(yīng)，采用顯微鏡技術(shù)觀察某些化學(xué)成分或酶活性在組織或細(xì)胞內(nèi)的定性、定位和定量及其變化規(guī)律,Histochemistry and cytochemistry,一、緒論,2. 組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的特點(diǎn),H­E染色,H­E染色,普通組織學(xué)技術(shù)：組織原位，染色，顯微鏡觀察,一、緒論,組織原位，特異性的化學(xué)反應(yīng)，顯微鏡

3、觀察——對組織或者細(xì)胞內(nèi)特定物質(zhì)進(jìn)行定性，定位， 定量分析,組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù),鉛法（ATP酶）,2. 組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的特點(diǎn),一、緒論,PAS法顯示粘多糖,3. 組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的主要類型,(1) 一般組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)(2) 免疫組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)(3) 原位雜交組織化學(xué)* 每種均有光鏡和電鏡之分和定性與定量之分,一、緒論,化學(xué)方法，類化學(xué)方法，物理學(xué)方法，顯微燒灰方法，免疫學(xué)方法，分子生物學(xué)方法等,常用分類

4、：,4. 組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的基本要求,一、緒論,保持組織和細(xì)胞的完整性 被檢物質(zhì)具有不溶性和（或）可視性 反應(yīng)具有特異性 反應(yīng)具有靈敏性 可重復(fù)性,,1. 取材（draw material）(1) 組織標(biāo)本取材：準(zhǔn)備充分、麻醉或處死方法合適、操作迅速、刀應(yīng)銳利、適當(dāng)清洗、離體即固定（或冷凍切片，或保存于-80℃冰箱）、大小適中（約2.5cm×2.5cm×0.2cm，寧可面積大，不能厚）(2) 細(xì)胞

5、標(biāo)本取材：涂片法：培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞，人體液中的細(xì)胞等，細(xì)胞密度低時(shí)可先沉淀或者離心；爬片法：貼壁生長的培養(yǎng)細(xì)胞；印片法：活組織標(biāo)本、尸檢標(biāo)本及子宮頸外口等脫落細(xì)胞,二、標(biāo)本的制備,,2. 固定（fixation）(1) 固定的目的：保持組織細(xì)胞原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)；使組織硬化；對組織化學(xué)及細(xì)胞化學(xué)技術(shù)來說---保存酶活性和蛋白質(zhì)的抗原性非常重要(2) 固定的優(yōu)、缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：使組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)得到保持缺點(diǎn)：擬檢物質(zhì)反應(yīng)性減弱，酶

6、的活性易受損,二、標(biāo)本的制備,二、標(biāo)本的制備,2. 固定,(3) 常用固定劑的種類及特點(diǎn)單一固定劑：交聯(lián)固定劑甲醛、多聚甲醛、戊二醛等：與蛋白多肽鏈氨基酸側(cè)鏈的功能基團(tuán)，如氨基、羥基、酰氨基等結(jié)合，使蛋白分子相互交聯(lián)，保存抗原于原位。其特點(diǎn)是組織形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，穿透性強(qiáng)，組織收縮少。但是，醛基與抗原蛋白氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇的空間構(gòu)象出現(xiàn)障礙，可能部分或完全遮蓋抗原決定簇，在免疫組織化學(xué)染色時(shí)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。固定時(shí)縮短固

7、定時(shí)間（8?24小時(shí)），降低固定溫度（4℃）、固定后充分水洗、在免疫組織化學(xué)染色之前通過抗原修復(fù)等可提高抗原反應(yīng)性。常用的有：10%福爾馬林（即4%甲醛）、4%多聚甲醛（應(yīng)用最為廣泛）、2.5%戊二醛等戊二醛含兩個(gè)醛基，對膜結(jié)構(gòu)固定更好，但是形成更多的交聯(lián)，對抗原活性有影響,二、標(biāo)本的制備,2. 固定,(3) 常用固定劑的種類及特點(diǎn)單一固定劑：凝固沉淀固定劑丙酮、甲醇/乙醇、苦味酸、乙酸、三氯乙酸和氯化汞等：使組織細(xì)胞中的蛋白質(zhì)

8、、糖等物質(zhì)凝固，優(yōu)點(diǎn)是滲透力強(qiáng)，對抗原活性和酶活性保存較好；缺點(diǎn)是固定快，易使組織細(xì)胞收縮，小分子物質(zhì)不容易保存，膜結(jié)構(gòu)會(huì)破壞，因此對細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存不好。固定方法在4℃，30~60 min 為宜。其他固定劑鉻酸、重鉻酸鉀、四氧化鋨等四氧化鋨：非電解質(zhì)強(qiáng)氧化劑，與氨基酸、肽和蛋白質(zhì)反應(yīng)形成交聯(lián)，保存微細(xì)結(jié)構(gòu)作用好，對組織收縮和膨脹的影響小，電鏡技術(shù)常用的固定劑,二、標(biāo)本的制備,2. 固定,(3) 常用固定劑的種類及特點(diǎn)混合固定劑：

9、Bouin固定液、Carnoy固定液、Zamboni固定液等Bouin固定液：甲醛、冰乙酸和飽和苦味酸按一定比例混合，是常用的混合固定劑，特點(diǎn)是穿透力強(qiáng)、收縮作用小、固定均勻，缺點(diǎn)是該固定液偏酸性，對抗原活性有影響Carnoy固定液：冰乙酸、氯仿和無水乙醇組成，適于固定染色體、DNA、RNA、糖原和尼氏體等，組織化學(xué)技術(shù)常用Zamboni固定液：多聚甲醛、飽和苦味酸和Karasson-Schwilt磷酸鹽緩沖液組成，類似于Boui

10、n固定液，對超微結(jié)構(gòu)的保存優(yōu)于Bouin固定液,,2. 固定(4) 固定的方法浸漬法、灌注法、滴片法、原位法、蒸汽法和微波法等，浸漬法和灌注法用的最多浸潤法：適用于臨床取材的標(biāo)本和小動(dòng)物組織固定，做好標(biāo)記，直接將組織塊修整為合適大小，投入到樣品體積的40倍左右的固定劑中，固定劑的種類和固定時(shí)間的長短根據(jù)情況而定,二、標(biāo)本的制備,,2. 固定(4) 固定的方法：灌流法：適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對缺氧敏感的器官，如神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸等取材。

11、,二、標(biāo)本的制備,包括推注，滴注滴注步驟(大鼠)：開胸- 暴露心臟- 自心尖剪開左心室-插入灌流針至主動(dòng)脈弓- 固定灌流針-快速注入沖洗液，剪開右心耳- 先快后慢注入固定液- 慢注畢，將動(dòng)物裝入含少量固定液的塑料袋置4ºC冰箱內(nèi)靜置2h后取材（或立即取材），放入固定液中進(jìn)行后固定大動(dòng)物多采用輸液方式，將固定液從一側(cè)頸總動(dòng)脈或股動(dòng)脈輸入，從另一側(cè)切開靜脈放血固定液的輸入量因個(gè)體不同而異，500～2,000毫升不等,沖洗液

12、,固定液,動(dòng)物,,2. 固定(5) 影響固定的因素：組織塊不宜過大： 組織塊過大會(huì)影響固定劑的滲透固定液的量要合適：固定液的量要超過組織塊大小的20倍-30倍，可在固定組織的瓶底墊上脫脂棉或幾層濾紙，保證組織塊各個(gè)方向都有利于固定劑的滲入選擇合適的固定劑：根據(jù)不同的組織以及后續(xù)研究方法的特點(diǎn)選擇合適的固定劑，滲透性強(qiáng)，又不使組織過度收縮或者膨脹固定時(shí)間的長短：根據(jù)固定劑的種類、組織塊的大小和性質(zhì)、氣溫等不同而確定，固定時(shí)間太短

13、，不能保持組織塊的微細(xì)結(jié)構(gòu)，固定時(shí)間過長，會(huì)降低組織內(nèi)物質(zhì)的反應(yīng)活性，如酶的活性，對抗原的保存也不利(5) 固定后的洗滌：根據(jù)不同情況充分洗滌,二、標(biāo)本的制備,,3. 包埋（embedding）(1) 包埋的目的：將某種特殊的支持物質(zhì)浸入到組織塊內(nèi)部，利用支持物（即包埋劑）的理化特性（如由固態(tài)變液態(tài)，液態(tài)變固態(tài)等），將整個(gè)組織加以包裹，最后凝固成均勻一致的固態(tài)結(jié)構(gòu)，用切片機(jī)切成極薄的切片(2) 包埋劑的種類：非水溶性：石蠟、樹

14、脂、火棉膠等，包埋前必須脫水和透明水溶性：明膠、OCT（聚乙二醇和聚乙烯醇的混合物）等，包埋前不需要脫水和透明,二、標(biāo)本的制備,,3. 包埋(3) 石蠟包埋：石蠟與水不相溶，包埋前必須脫水和透明，然后用熔化的液態(tài)石蠟對組織進(jìn)行浸透，將浸透好的組織和石蠟放在室溫條件下讓其凝固，方便切成極薄的切片脫水（dehydration）：用脫水劑置換組織中的水分，脫水會(huì)使組織收縮、變脆，因此脫水劑的濃度由低到高，采用合適的脫水劑和脫水時(shí)間（

15、與組織塊大小和結(jié)構(gòu)性質(zhì)相關(guān)），最常用的為乙醇，組織比較致密可用正丁醇,二、標(biāo)本的制備,* 柔軟的組織可從更低的濃度開始，脫水的容器密閉性要好，防止吸收空氣中的水分,,3. 包埋(3) 石蠟包埋：透明（clearing）：脫水劑一般跟石蠟不互溶，用透明劑置換脫水劑，并使組織呈現(xiàn)透明狀態(tài)，便于浸蠟和包埋常用透明劑為二甲苯、苯、甲苯、氯仿、正丁醇、香柏油等二甲苯透明能力強(qiáng)，易使組織收縮變脆，因此時(shí)間不能太長?？梢越?jīng)常觀察透明進(jìn)展。

16、如果脫水不徹底，會(huì)出現(xiàn)“棗核”樣的非透明區(qū)，必須返回到脫水劑中重新徹底脫水,二、標(biāo)本的制備,,3. 包埋(3) 石蠟包埋：浸蠟（paraffin infiltration）：使熔化的石蠟液浸入到已經(jīng)透明的組織中，徹底置換掉透明劑。浸蠟選擇熔點(diǎn)為58~60ºC的石蠟，制備免疫組織化學(xué)標(biāo)本應(yīng)該選用更低熔點(diǎn)的石蠟，更換1~2次，每次0.5~1小時(shí)* 浸蠟和包埋所用的石蠟必須經(jīng)過熔化后用濾紙過濾除去雜質(zhì)* 將組織塊從透明劑中

17、移入到液態(tài)的石蠟中時(shí)，動(dòng)作要迅速，否則液態(tài)的石蠟很容易凝固，影響到浸蠟的效果,二、標(biāo)本的制備,,3. 包埋(3) 石蠟包埋：包埋（embedding）：將已浸蠟的組織塊置入裝有新熔化石蠟的包埋模具內(nèi)，移出烤箱，即會(huì)迅速冷卻凝固，包埋時(shí)注意將標(biāo)本的切面向下，即標(biāo)本的切面接觸包埋模具的底面* 將組織塊從浸蠟中移入到包埋模具中，動(dòng)作要非常迅速，否則石蠟很容易凝固，影響包埋效果* 包埋的溫度不能過高或者過低，普通組織學(xué)染色可以在65&

18、#186;C，免疫組織化學(xué)染色不能高于60ºC,二、標(biāo)本的制備,,3. 包埋(3) 石蠟包埋：修塊：石蠟?zāi)毯?，組織便包封在石蠟內(nèi)。切片前需把包有組織的蠟塊修成一定形狀，并且把各個(gè)面修平，注意不能使蠟邊與組織邊靠得太近亦不能太遠(yuǎn)，近則不易連片，遠(yuǎn)則廢切片刀。在修塊時(shí)選適當(dāng)?shù)牡胤阶鰳?biāo)記，便于日后辨認(rèn),二、標(biāo)本的制備,,3. 包埋(4) 火棉膠包埋：常用于較大組織和器官的包埋，如大小腦，以及容易塌陷的器官，如眼球和胚胎器

19、官等，對組織的收縮作用小，保持原有結(jié)構(gòu)的效果好，但火棉膠包埋所需時(shí)間長，包埋的組織塊不能做薄切片和連續(xù)切片火棉膠溶液配制：稱取干燥的固態(tài)火棉膠，溶解于100ml的乙醚-無水乙醇（比例是1:1）配制成2%、4%、8%、16%的火棉膠液備用?；鹈弈z不易溶解，將其置入棕色瓶子內(nèi)，經(jīng)常搖動(dòng)* 固體狀態(tài)的火棉膠和配制成液體的火棉膠，均是易燃品，因此使用過程中要避開明火*火棉膠容易吸收水分而成乳白狀，在貯存和使用過程中要注意防水,二、標(biāo)本的

20、制備,,3. 包埋(4) 火棉膠包埋：包埋：梯度酒精脫水，乙醚-無水乙醇浸泡24 h，（不需透明）在不同濃度的火棉膠中分別浸泡24 h到1周，取出后放入含足量16%火棉膠的包埋盒中硬化：繼而放入干燥箱內(nèi)放置24 h，開啟盒蓋，使乙醇和乙醚揮發(fā)，包埋塊逐漸硬化呈膠樣，去掉包埋盒，包埋好的組織塊放入70%乙醇或氯仿中24 h，最后放入1:1的95%乙醇-甘油中保存?zhèn)溆?二、標(biāo)本的制備,,3. 包埋(5) 樹脂包埋：以樹脂作為包

21、埋劑，包埋質(zhì)地堅(jiān)硬，易于制作很薄的切片。電鏡水平的標(biāo)本包埋常用環(huán)氧樹脂，其包埋方法見《電子顯微鏡技術(shù)》中“超薄切片技術(shù)”，光鏡水平的標(biāo)本包埋常用水性樹脂-甲基丙烯酸-2-羥基乙基酯包埋劑配制：分別配制浸透劑和催化劑標(biāo)本固定和脫水：醛類固定劑常用，梯度酒精脫水，但是脫水可不徹底包埋：先入浸透劑，后入浸透劑和催化劑混合液中進(jìn)行聚合包埋,二、標(biāo)本的制備,,4. 切片（section）必須切成薄片才能染色重點(diǎn)介紹石蠟切片、冰凍切片和振

22、動(dòng)切片石蠟切片：優(yōu)點(diǎn)：切片較薄，4~8µm，組織結(jié)構(gòu)保存好，抗原定位準(zhǔn)確，連續(xù)切片缺點(diǎn)：脫水透明及高溫包埋，處理時(shí)間長，抗原活性容易受損，脂類物質(zhì)等易被溶解過程：固定蠟塊-調(diào)整切面-修塊-調(diào)整切片厚度-切片-展片-貼片-烤片,二、標(biāo)本的制備,,4. 切片（section）(2) 冰凍切片（恒冷箱切片機(jī)）：優(yōu)點(diǎn)：不用脫水透明高溫包埋，處理時(shí)間大為縮短，抗原保存較好，可用于未固定的標(biāo)本切片缺點(diǎn)：容易形成冰晶，切片較

23、厚，10~40µm，結(jié)構(gòu)清晰度不如石蠟切片防止冰晶形成的方法：高滲蔗糖溶液處理：20%-30%蔗糖?PB溶液浸泡1~3天，組織塊沉底速凍：放組織塊入-80ºC干冰或-196ºC液氮中速凍，或者將組織塊固定在將溫度已經(jīng)下降到-50ºC的凍頭上速凍* 速凍前組織塊都經(jīng)過高滲蔗糖浸泡過過程：開機(jī)預(yù)冷-組織包埋（用OCT包埋組織于切片托上）-切片-貼片-干燥-保存（如長期保存可存放于-20

24、86;C，如短期可室溫放置，但防塵）,二、標(biāo)本的制備,,4. 切片（section）,二、標(biāo)本的制備,(2) 冰凍切片（恒冷箱切片機(jī)）：,,(3) 振動(dòng)切片：利用振動(dòng)切片機(jī)的振動(dòng)，使刀片橫向往復(fù)切割，將組織切成薄片優(yōu)點(diǎn)：因組織不冷凍，無冰晶形成，染色前又避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對抗原的損害，故能較好地保留組織內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細(xì)胞膜抗原，標(biāo)本可以是經(jīng)過固定的或者新鮮的（少數(shù)情況下）缺點(diǎn)：切片較前兩種方法厚，20~400&#

25、181;m，結(jié)構(gòu)清晰度較差,二、標(biāo)本的制備,4. 切片（section）,,4. 切片(4) 防脫片處理：A. 載玻片和蓋玻片的處理黏附劑的使用------ 蛋白甘油------ 鉻礬明膠液 ：鉻礬（0.05%）、明膠（0.5%）和疊氮鈉（0.01%）------ 多聚賴氨酸：0.01~0.05%C. 直接購買已經(jīng)制備好的防脫片載玻片,二、標(biāo)本的制備,,5. 非切片標(biāo)本制備無需切片即可制成標(biāo)本的制備方法，包括細(xì)胞涂片、

26、分離組織、組織磨片、整體封存、組織鋪片等細(xì)胞涂片：如血涂片組織分離標(biāo)本：化學(xué)溶解法或者酶消化法組織磨片法：骨磨片整體封存標(biāo)本：早期雞胚、運(yùn)動(dòng)終板等組織鋪片：結(jié)締組織鋪片,二、標(biāo)本的制備,,6. 標(biāo)本封固標(biāo)本經(jīng)過染色等系列處理后，需封固，即將蓋玻片和載玻片粘在一起，方便照相和保存含水封固劑：甘油、甘油明膠、液體石蠟（用于整體標(biāo)本的封固），Clear-Mount（不需蓋玻片）優(yōu)點(diǎn)：無需脫水，因此不導(dǎo)致組織收縮變形缺點(diǎn)：失水

27、導(dǎo)致封固劑干縮，封固不牢無水封固劑：天然樹膠、人工合成樹膠（中性樹膠）優(yōu)點(diǎn)：封固牢固，長期保存缺點(diǎn)：切片必須徹底脫水和透明，可能導(dǎo)致組織收縮，二甲苯有毒，必須在通風(fēng)櫥內(nèi)操作,二、標(biāo)本的制備,,7. 組織芯片（tissue chip）技術(shù)又稱組織微陣列，是生物芯片的一種，將千百個(gè)組織標(biāo)本整齊有序的排列在固相載體上，制成縮微的組織切片，結(jié)合免疫組織化學(xué)、原位雜交等技術(shù)，對多種不同生物組織同時(shí)進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)比較、基因和蛋白表達(dá)水平的定位

28、檢測優(yōu)點(diǎn)：大樣本高通量，高效性，平行性和實(shí)驗(yàn)誤差小問題：人體標(biāo)本石蠟組織庫的建立，組織芯片制備的標(biāo)準(zhǔn)化，組織芯片的自動(dòng)化分析,二、標(biāo)本的制備,,8. 顯微切割 技術(shù)（microdissection）在顯微狀態(tài)或顯微鏡直視下，通過顯微操作系統(tǒng)，從組織切片或者細(xì)胞涂片中切割分離欲研究的材料，如組織、細(xì)胞群、單個(gè)細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)組分或者染色體等,二、標(biāo)本的制備,激光捕獲顯微切割系統(tǒng)操作步驟,A，準(zhǔn)備組織；B，定位細(xì)胞；C，放置帶有EVA膜的

29、收集蓋；D，激發(fā)激光；E，分離目的組織；F，下游實(shí)驗(yàn)分析,非接觸式激光顯微切割方法- Leica Laser Microdissection,A，劃定目標(biāo)區(qū)域；B，控制激光沿切割線移動(dòng)；C，目的樣品通過重力收集,,生物燃料將無色的組織和細(xì)胞染上不同的顏色，便于顯微鏡觀察，廣泛應(yīng)用于組織學(xué)和病理學(xué)等學(xué)科蘇木精-伊紅（HE）染色（hematoxylin-eosin staining）染色原理：蘇木精為堿性染料，使細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)的嗜堿性物

30、質(zhì)染成紫藍(lán)色，伊紅為酸性染料，使胞質(zhì)中的嗜酸性物質(zhì)染成紅色或粉紅色石蠟切片HE染色步驟：脫蠟（二甲苯）：充分徹底梯度酒精水化100%I-100%II-95%-80%-70%-水蘇木精染色時(shí)間根據(jù)情況而變化,三、常用組織學(xué)染色技術(shù),,蘇木精-伊紅（HE）染色（hematoxylin-eosin staining）(2) 石蠟切片HE染色步驟：水洗：用自來水洗，弱堿性，加強(qiáng)蘇木精的著色分色：將過度染色和無需染色的部分去

31、掉，70%酒精配制的0.5%~1%鹽酸處理數(shù)秒，使細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)顯示清晰，對比明顯藍(lán)化：如果分色后染色較弱，可入0.5%~1%氨水中藍(lán)化伊紅染色：切片在0.5%~1%伊紅中染色2~3分鐘，自來水洗去多余的染液。伊紅染色切忌過強(qiáng)，水洗要快速,三、常用組織學(xué)染色技術(shù),,蘇木精-伊紅（HE）染色（hematoxylin-eosin staining）(2) 石蠟切片HE染色步驟：脫水：用梯度酒精脫水，70%-80%-95%-10

32、0%I-100%II，濃度低的酒精有脫色作用，時(shí)間不能長，高濃度酒精中時(shí)間要足夠，脫水要徹底透明：切片入二甲苯I、II中各10分鐘，將酒精置換出，并且使切片清澈透明，切記在通風(fēng)櫥中操作封片及鏡檢：濾紙吸干組織周圍的二甲苯，滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，防止形成氣泡，顯微鏡觀察，切片平放，自然干燥,三、常用組織學(xué)染色技術(shù),,蘇木精-伊紅（HE）染色（hematoxylin-eosin staining）,三、常用組織學(xué)染色技術(shù),結(jié)果觀

33、察,,2. 神經(jīng)組織鍍銀染色將固定后的組織或切片浸于銀溶液中，再用還原劑出來，使銀顆粒附著在組織結(jié)構(gòu)上，使之呈現(xiàn)出深棕色或者黑色親銀性：某些組織（如神經(jīng)組織）經(jīng)硝酸銀處理后可使硝酸銀還原，這種性質(zhì)即親銀性嗜銀性：有些結(jié)構(gòu)（如網(wǎng)狀纖維）不直接還原銀，需加入還原劑才能顯示銀顆粒，為嗜銀性神經(jīng)纖維鍍銀改良法染色：(1) 試劑：20%硝酸銀，氨銀液（硝酸銀-無水乙醇-氫氧化銨），0.2%氯化金，5%硫代硫酸鈉，麗春紅酸性品紅溶液，1%

34、磷鉬酸，淡綠液（淡綠和冰乙酸）,三、常用組織學(xué)染色技術(shù),,2. 神經(jīng)組織鍍銀染色神經(jīng)纖維鍍銀改良法染色：(2) 染色步驟：略(3) 結(jié)果觀察,三、常用組織學(xué)染色技術(shù),,四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),組織化學(xué)的基本原理,組織原位，特異性的化學(xué)反應(yīng)，顯微鏡觀察——對組織或者細(xì)胞內(nèi)特定物質(zhì)進(jìn)行定性，定位， 定量分析,組織化學(xué)的基本特點(diǎn),,碳水化合物組織化學(xué)技術(shù)（以PAS反應(yīng)為例）碳水化合物也稱為糖類化合物，常含有一個(gè)醛基或者水解后產(chǎn)生醛

35、基，組織結(jié)構(gòu)內(nèi)以黏多糖最常見，中性黏多糖可用過碘酸-雪夫（periodic acid-Schiff，PAS）反應(yīng)顯示，酸性黏多糖可用阿利新藍(lán)（alician blue，AB）反應(yīng)顯示原理：過碘酸為強(qiáng)氧化劑，可氧化黏多糖產(chǎn)生游離醛基，與Schiff試劑中無色的亞硫酸品紅反應(yīng)，生成紫紅色沉淀物，根據(jù)沉淀物的位置和顏色的強(qiáng)度判斷黏多糖的分布部位和含量的多少，但是要注意控制好氧化時(shí)間，過碘酸的pH值以3.0~5.0為佳*** 固定劑不能選用

36、醛類固定劑（尤其不能選用含兩個(gè)醛基的固定劑），常用Carnoy固定液（無水乙醇-氯仿-冰乙酸）,四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),,2. 脂類組織化學(xué)技術(shù)（以油紅O染色法為例）脂類是構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要化合物，酸性脂類包括脂肪酸和磷脂等，中心脂類包括甘油三酯、膽固醇及固醇脂、類固醇及糖脂等。常用甲醛鈣固定，甲醛不能直接固定脂類，但是可固定脂類周邊的蛋白質(zhì)，鈣離子有利于保存磷脂，固定時(shí)間不宜超過10 min；常用冰凍切片（為什么不能使用石蠟切

37、片？）；油紅O染色法（物理顯色法中的一種）：原理：油紅O屬于偶氮染料，是很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結(jié)合形成小脂滴。染液入組織中，染料（染料在溶劑中的溶解度小于在脂類物質(zhì)中的溶解度）可溶解于組織中的脂類中，使組織中的脂滴染成紅色,四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),,3. 酶組織化學(xué)技術(shù)酶是體內(nèi)特殊的蛋白質(zhì)，每種酶可以催化特定的化學(xué)反應(yīng)。用組織化學(xué)的方法在一定條件下加入酶的底物，底物在酶的催化作用下產(chǎn)生了反應(yīng)產(chǎn)物，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的分布及量

38、可檢測酶的分布和活性。為了不損失酶活性，審慎選擇固定方法,四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（1）基本原理,,3. 酶組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（2）常用顯示方法,偶聯(lián)偶氮色素法：又稱偶氮色素法，用某種人工合成底物在酶作用下產(chǎn)生分解產(chǎn)物，后者與重氮鹽結(jié)合，引起偶聯(lián)偶氮反應(yīng)，形成不溶性偶氮色素A. 同時(shí)偶聯(lián)法：該法是孵育液中的底物被酶分解后所產(chǎn)生的反應(yīng)物沉淀立即與重氮鹽形成重氮化合物的偶氮色素而顯色B. 后偶聯(lián)法：該法是

39、為了防止重氮鹽對酶的抑制作用，而先使酶作用于底物，使其分解產(chǎn)生反應(yīng)物沉淀，然后將其浸漬于重氮鹽溶液中，使其形成偶氮色素而顯色,偶聯(lián)偶氮色素法：,,3. 酶組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（2）常用顯示方法,金屬-金屬鹽顯示法 : 金、銀、銅、鐵、鉛、鈷等金屬本身或其鹽和化合物具有顏色，容易發(fā)生呈色反應(yīng)，酶的分解產(chǎn)物與這些金屬結(jié)合，呈現(xiàn)顏色A. 鈣-鈷法：,,3. 酶組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（2）常用顯示方法,金

40、屬-金屬鹽顯示法 : 金、銀、銅、鐵、鉛、鈷等金屬本身或其鹽和化合物具有顏色，容易發(fā)生呈色反應(yīng)，酶的分解產(chǎn)物與這些金屬結(jié)合，呈現(xiàn)顏色B. 鉛法：,,3. 酶組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（2）常用顯示方法,色素形成法 : 在酶的作用下，無色的化學(xué)物質(zhì)在局部形成有色的色素沉著。有四種類型A. 四唑鹽法：顯示脫氫酶,四唑鹽(無色),甲月朁 （紅色）,,3. 酶組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（2）常用顯示方法,色素形成

41、法 : 在酶的作用下，無色的化學(xué)物質(zhì)在局部形成有色的色素沉著。有四種類型，B. 靛酚藍(lán)法：檢測氧化酶C. 靛藍(lán)形成法：顯示磷酸酶和酯酶等D. 聯(lián)苯胺色素法：主要用于證明過氧化物酶，過氧化物酶作用于過氧化氫，釋放出原子氧，后者將無色的聯(lián)苯胺氧化成有色的多聚體沉淀物，沉淀于酶所在的部位免疫組織化學(xué)法：酶是蛋白質(zhì)，可用相應(yīng)的抗體檢測，檢測的主要是酶的表達(dá)，而不能等同于酶的活性（詳見免疫組織化學(xué)技術(shù)）,,3. 酶組織化學(xué)技術(shù),四、常用一

42、般組織化學(xué)技術(shù),（3）過氧化物酶組織化學(xué)技術(shù),原理：過氧化物酶作用于過氧化氫（底物），釋放出原子氧，后者將無色的聯(lián)苯胺（二氨基聯(lián)苯胺DAB或者四甲基聯(lián)苯胺TMB）氧化成多聚體有色沉淀，DAB被氧化成棕色沉淀，TMB被氧化成深藍(lán)色沉淀，位于酶所在的部位孵育液：含DAB、Tris-HCl緩沖液及H2O2** 孵育液使用前混合對照實(shí)驗(yàn)：加入酶的抑制劑氰化鉀或者疊氮鈉,,3. 酶組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（4）琥珀酸脫氫酶（

43、SDH）組織化學(xué)技術(shù),原理：SDH是線粒體呼吸鏈的第一個(gè)酶，是三羧酸循環(huán)的標(biāo)志酶，也是線粒體的標(biāo)志酶，可用硝基藍(lán)四唑鹽法顯示，SDH以黃素蛋白為輔基，將琥珀酸氧化為延胡索酸并釋放出氫，后者將淡藍(lán)四唑（NBT）還原為藍(lán)色的甲月朁孵育液：含NBT，二甲基亞砜（DMSO），琥珀酸和0.1MPB緩沖液**SDH對固定敏感，最好新鮮標(biāo)本經(jīng)冰凍切片后，2%甲醛固定5min，如果是必須固定的組織，建議降低固定液濃度，縮短固定時(shí)間**先用DMSO

44、溶解NBT，再加入琥珀酸和磷酸緩沖液對照實(shí)驗(yàn)：不加底物或者加入酶的抑制劑丙二酸鹽,,3. 酶組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（5）酸性磷酸酶（ACP）組織化學(xué)技術(shù),原理：ACP是溶酶體的標(biāo)志酶，顯示方法多采用金屬法中的鉛法。孵育液：含乙酸鹽緩沖液，蔗糖，硝酸鉛，β-甘油磷酸鈉** ACP對固定敏感，新鮮標(biāo)本經(jīng)冰凍切片后，4%甲醛固定10min**先將β-甘油磷酸鈉溶解于緩沖液，后緩慢滴加硝酸鉛，不停攪拌，或者將前

45、面三項(xiàng)物質(zhì)混合溶解，少量多次逐漸加入β-甘油磷酸鈉，孵育液過濾后使用，注意pH值對照實(shí)驗(yàn)：孵育液中加入酶的抑制劑氟化鈉,,3. 酶組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（6）堿性磷酸酶（ALP）組織化學(xué)技術(shù),原理：ALP在堿性環(huán)境下（pH9.2~9.4）可催化酚和醇的磷酸酯水解，并轉(zhuǎn)移磷酸，多分布于細(xì)胞膜運(yùn)輸活躍的細(xì)胞。顯示方法有鈣-鈷法和偶聯(lián)-偶氮色素法兩種。鈣-鈷法的原理為，堿性環(huán)境下，底物β-甘油磷酸鈉在ALP作用下產(chǎn)生磷酸，

46、與鈣形成無色的磷酸鈣沉淀，加入硝酸鈷，形成仍然無色的磷酸鈷沉淀，最后用硫化銨處理，形成棕黑色的硫化鈷沉淀孵育液：含氯化鈣，巴比妥鈉，β-甘油磷酸鈉，硫酸鎂*** ALP對固定敏感，新鮮標(biāo)本經(jīng)冰凍切片后，4%甲醛固定10min，*** 注意pH值對照實(shí)驗(yàn)：不加底物或者加入酶的抑制劑L-四唑咪,,3. 酶組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（7）乙酰膽堿酯酶（AchE）組織化學(xué)技術(shù),原理：將乙酰膽堿鹽水解產(chǎn)生硫膽堿，進(jìn)而還原鐵氰化

47、物為亞鐵氰化物，后者與銅離子結(jié)合成亞鐵氰化銅棕色沉淀孵育液：含乙酰硫代膽堿碘鹽，乙酸緩沖液，檸檬酸鈉，硫酸銅，鐵氰化鉀*** 對固定敏感，新鮮標(biāo)本經(jīng)冰凍切片后，4%甲醛固定20min對照實(shí)驗(yàn)：不加底物或者加入酶的抑制劑毒扁豆堿硫酸酯,3. 酶組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（8）一氧化氮合酶（NOS）組織化學(xué)技術(shù),對照實(shí)驗(yàn)：不加底物或者加入酶的抑制劑N-亞硝基精氨酸預(yù)孵育,NOS是一種重要的連接酶，NO是一種神

48、經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞間信使、內(nèi)皮源性的松弛血管的介質(zhì)，但是極不穩(wěn)定，常用NOS的活性來判斷NO的分布和量，而NOS與還原型輔酶II-黃遞酶（NADPH-d）的化學(xué)結(jié)構(gòu)和組織定位高度一致，常用NADPH-黃遞酶法顯示NOS,3. 酶組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（9）酶組織化學(xué)染色注意事項(xiàng),標(biāo)本制備：組織的準(zhǔn)備和切片的制作不能影響酶的活性和分布溫度：任何酶促反應(yīng)都有相應(yīng)的最適溫度pH值：各種酶促反應(yīng)具有各自合適的pH值范圍孵育液各

49、成分的濃度：酶反應(yīng)速度受孵育液內(nèi)參與反應(yīng)的各種成分（底物、捕捉劑、激活劑、抑制劑等）濃度的影響激活劑：激活劑是能使酶活性增強(qiáng)的物質(zhì)。檢測某些活性較低的酶時(shí)，應(yīng)使用激活劑增強(qiáng)酶的活力抑制劑：抑制劑系指某些物質(zhì)在不引起酶蛋白變性情況下，使酶活性減弱，抑制酶的活力，甚至使酶活性消失的物質(zhì)。抑制劑主要分為非特異性、特異性和競爭性三類對照實(shí)驗(yàn)：酶的抑制劑；不加底物；陽性對照,,4. 核酸組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（1）Feul

50、gen反應(yīng),原理：DNA在酸性環(huán)境下水解，嘌呤-脫氧核糖間的糖苷鍵打開，形成醛基，與無色的Schiff試劑反應(yīng)，形成紫紅色反應(yīng)沉淀產(chǎn)物*** 不能用新鮮標(biāo)本（含有縮醛磷脂，導(dǎo)致非特異反應(yīng)），需經(jīng)Carnoy固定液固定后石蠟切片；*** 處理時(shí)間不能過長，會(huì)導(dǎo)致DNA完全水解，反而不能顯示*** Schiff試劑中的SO2易逸出，要用棕色瓶并塞緊瓶蓋低溫保存對照實(shí)驗(yàn)：不加底物或者加入酶的抑制劑毒扁豆堿硫酸酯,核酸（nucleic

51、acid）是生物遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，包括DNA、RNA，前者分布于細(xì)胞核，后者分布于核仁和胞質(zhì)的核糖體內(nèi)。主要介紹Feulgen反應(yīng)和三種常用的熒光素染色法,,4. 核酸組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（2）DAPI染色,原理、特征及應(yīng)用：特異性熒光染料DAPI（4,6-二氨基-2-苯基吲哚）對DNA雙鏈具有很強(qiáng)親和力，能與雙鏈DNA小溝結(jié)合，結(jié)合后熒光增強(qiáng)20倍，而與單鏈DNA結(jié)合無熒光增強(qiáng)，與RNA結(jié)合熒光增強(qiáng)也不如雙鏈DNA；D

52、API具有膜通透性，可區(qū)別未經(jīng)固定的活細(xì)胞（較弱的藍(lán)色熒光）和凋亡細(xì)胞（產(chǎn)生很強(qiáng)的藍(lán)光染色），DAPI的熒光強(qiáng)度較Hoechst低，但熒光穩(wěn)定性優(yōu)于Hoechst；廣泛用于流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡和微孔板高通量熒光分析；因?yàn)槭撬{(lán)光，可以與FITC、GFP或Texas Red等熒光染料合用進(jìn)行多參數(shù)分析，DAPI也用于檢測細(xì)胞培養(yǎng)體系中的支原體或病毒DNA,,4. 核酸組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（2）DAPI染色,DAPI儲存

53、液：0.1mg/ml 溶于0.01MPBSDAPI工作液：0.1μg/ml，用0.01MPBS稀釋染色步驟：培養(yǎng)的單層細(xì)胞(未固定)或新鮮組織的冰凍切片等，PBS漂洗5 min；DAPI工作液室溫染色5~20 min（可根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料的染色結(jié)果而定）；PBS漂洗；水溶性封片劑封片，游離細(xì)胞也可直接用含DAPI 的PBS封片；熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察照相,,4. 核酸組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（3）Hoech

54、st染色,原理、特點(diǎn)及應(yīng)用：可與DNA分子結(jié)合，為非嵌入性熒光染料，在活細(xì)胞中DNA的AT序列富集區(qū)域的小溝處與DNA結(jié)合，活細(xì)胞或固定細(xì)胞均可從低濃度溶液中攝取該染料, 從而使細(xì)胞核著色為藍(lán)色熒光。Hoechst可穿過細(xì)胞膜，可用于流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和監(jiān)測DNA凝集, 在活細(xì)胞和固定的細(xì)胞中均適用。在凋亡細(xì)胞中，細(xì)胞膜對Hoechst33258的攝取增高，并且由于染色體高度濃縮，Hoechst33258與之結(jié)合增強(qiáng)，染色呈強(qiáng)藍(lán)色熒

55、光，而正常細(xì)胞只呈微弱熒光，死細(xì)胞則不被染色染色步驟基本同DAPI,Hoechst33258染色示C6細(xì)胞株細(xì)胞核,,4. 核酸組織化學(xué)技術(shù),四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),（3）碘化丙啶（PI）染色,原理：PI可嵌入核酸的雙鏈，與核酸結(jié)合后熒光強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)20~30倍，為紅色熒光特點(diǎn)：PI不能穿入完整的活細(xì)胞膜中，即正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞在不固定的情況下對PI拒染，而壞死細(xì)胞由于失去膜的完整性，PI可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合。應(yīng)用：可與Hoe

56、chst聯(lián)合使用來鑒別壞死、凋亡和活細(xì)胞。正?；罴?xì)胞對染料有拒染性，藍(lán)色和紅色熒光均較少；凋亡細(xì)胞有膜通透性改變，主要攝取Hoechst染料，表現(xiàn)為強(qiáng)藍(lán)色熒光，弱紅色熒光；壞死細(xì)胞由于有很強(qiáng)的PI嗜染性并可覆蓋Hoechest染色，故呈弱藍(lán)色強(qiáng)紅色熒光。如果對活細(xì)胞染色檢測細(xì)胞周期必須在染色前進(jìn)行固定，以增加細(xì)胞膜對染料的通透性,細(xì)箭示正常細(xì)胞，粗箭示凋亡細(xì)胞，箭頭示壞死細(xì)胞,5. 凝集素組織化學(xué)技術(shù)原理及特點(diǎn)：--- 凝集素 (l

57、ectin)是一種無免疫原性蛋白質(zhì)，具有凝集紅細(xì)胞的特性，故又稱植物血凝素--- 能識別糖蛋白與糖多肽中的碳水化合物，特異性地與糖蛋白中的糖基反應(yīng)，凝集素親和層析已成為近年分離純化糖蛋白的重要手段--- 凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與多種標(biāo)記物結(jié)合，可作為組織化學(xué)的特異性探針在光鏡或電鏡水平顯示其結(jié)合部位，廣泛用于糖蛋白的性質(zhì)、分布以及正常細(xì)胞更新過程中糖蛋白變化的研究凝集素的標(biāo)記物：--- 熒光素，辣根過氧化物酶、鐵蛋白、膠體金

58、、生物素等--- 已有上述標(biāo)記物標(biāo)記的商品出售，應(yīng)用時(shí)可直接購買,四、常用一般組織化學(xué)技術(shù),5. 凝集素組織化學(xué)技術(shù)熒光素標(biāo)記凝集素的組織化學(xué)：用熒光素標(biāo)記凝集素染色程序：組織切片經(jīng)脫蠟處理，冰凍切片直接進(jìn)入下一步；若是Bouin液固定的組織，用70％乙醇洗3次去除組織切片內(nèi)的黃色后，再用蒸餾水漂洗； PBS漂洗(含1％牛血清白蛋白)2次，每次5min；加入FITC-凝集素 (PBS適當(dāng)稀釋)，置濕盒內(nèi)孵育，室溫l h；