酶組織化學(xué)劉學(xué)光

1、酶組織化學(xué),劉學(xué)光復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系glxg69@shmu.edu.cn,酶是生物體內(nèi)具有催化作用的特殊蛋白質(zhì) 一般催化劑的共性： 1. 用量少而催化效率高 2. 不改變化學(xué)反應(yīng)的平衡點(diǎn) 3. 可降低反應(yīng)的活化能 作為生物催化劑的特性： 1. 催化效率高： 比其他催化反應(yīng)高107-1013倍 2. 高度專一性 3. 易失活 4.

2、 酶活力受調(diào)節(jié)控制 5. 酶的催化活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān),酶的分類、命名1.習(xí)慣命名法：底物，所催化的反應(yīng)性質(zhì)，來源，其他特點(diǎn)2.國際系統(tǒng)命名法：酶的底物 + 催化反應(yīng)的性質(zhì)3.主要分類：催化反應(yīng)的性質(zhì)，六個大類（1）氧化還原酶:氧化還原反應(yīng)（2）移換酶：功能基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)（3）水解酶：水解反應(yīng)（4）裂合酶：從底物上移去一個基團(tuán)而形成雙鍵，或其逆反應(yīng)（5）異構(gòu)酶：同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)變（6）合成酶：連

3、接酶 催化一切必須與ATP分解相偶聯(lián)且由兩種物質(zhì)（雙分子）合成一種物質(zhì)的反應(yīng),酶組織化學(xué)( Enzyme Histochemistry) 通過細(xì)胞內(nèi)固有的酶催化底物的作用，并借助顯色反應(yīng)，在切片或涂片上顯示組織或細(xì)胞中內(nèi)源性酶的活性及定位。 特點(diǎn) （1）原位檢測：組織定位 （2）顯示酶活性,發(fā)展歷史 Klebs(1868)年&Struve(1872)證明

4、中性多核白細(xì)胞過氧化酶存在1939年前，研究細(xì)胞內(nèi)的氧化反應(yīng)1939年，Takamatsu、Gomori 堿性磷酸酶（硫化鈷反應(yīng) 、銀反應(yīng)） 隨后：磷酰胺酶、 ATP酶、 脂酶、酯酶等 金屬鹽法，硫化鈷法，偶氮色素法，偶氮色素四唑鹽法，磷酸化酶組織化學(xué)證明法…… 電鏡酶組織化學(xué)：酶更精準(zhǔn)的定位 1955年 Scheldon、 Brandes 金屬沉淀法 1967年 Seli

5、gman 鋨黑化法 免疫組織化學(xué)：抗原抗體反應(yīng)+酶反應(yīng) 1970年 Sternberger 酶標(biāo)抗體法,基礎(chǔ)知識（一）細(xì)胞內(nèi)的酶的特性 * 水溶性，易擴(kuò)散，難溶或不溶于有機(jī)溶劑 * 有機(jī)溶劑不同程度降低酶的活性 * 易受溫度影響，對熱耐受性弱 * 對干燥耐受性強(qiáng),（二）酶的定位 在細(xì)胞內(nèi)或超微結(jié)構(gòu)中存在于特定部位 漿膜 — 5’

6、-核苷酸酶 細(xì)胞膜— ATPase 線粒體 ……,1. 酶促反應(yīng) 細(xì)胞內(nèi)的酶催化分解合適的底物，生成中間產(chǎn)物，即：初反應(yīng)物(primary reaction product, PRP)。2. 顯色反應(yīng) 其中之一再與輔助物經(jīng)一步或二步反應(yīng)，生成有色不溶水的終反應(yīng)物(final reaction product, FRP) 沉積在原位以顯示酶的存

7、在和活性大小。,酶組織化學(xué)的基本原理,Artifact — PRP彌散 → 定位不準(zhǔn)確 受3個因素影響： 1. 底物在酶催化下水解的速度 — 快 2. PRP在緩沖液中的彌散系數(shù) — 小 3. PRP與輔助物反應(yīng)的速度 — 快 輔助物濃度一般≦1 mg/ml,一般原則 最大限度保存酶活性、防止彌

8、散、保證反應(yīng)產(chǎn)物的特異性 1. 標(biāo)本處理及制片不能影響酶活性和分布 2. 底物對酶有特異性：酶抑制劑/激動劑檢測特異性 3. 底物和輔助試劑滲透好：迅速，同步 4. 輔助試劑不能影響酶活性和其它反應(yīng)劑的滲透 5. PRP與輔助試劑反應(yīng)要快 FRP必需是水不溶、有色且穩(wěn)定的物質(zhì) 6. 所有試劑不能與組織細(xì)胞有非特異性的吸附,主要步驟,1.組織處理：不固定（冷凍切

9、片，新鮮） 固 定（特殊固定劑，低溫包埋）2.孵育3.顯色4.顯微鏡下觀察各步驟需要注意的問題：,,1. 組織處理：“最大限度保存酶活性” 最常用：新鮮組織，快速冷凍，冰凍切片 長期保存需密封，-70℃ 丙酮固定，低溫脫水、包埋（eg. γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶） 常規(guī)方法（極少數(shù)酶類：氯乙酸酯酶）

10、 染色前的預(yù)固定 — 保持組織良好形態(tài) 丙酮:氯仿=1 : 1 4oC，5~10 分鐘 多聚甲醛，甲醛，戊二醛 Note: 含有抑制酶活性/細(xì)胞化學(xué)成分活性的重金屬鹽Hg/Cr/Pb等 不用做固定劑 固定方法：浸泡固定 灌流固定 細(xì)胞涂片、培養(yǎng)細(xì)胞: 干燥、密封、低溫,

11、2.切片制作: 一般8－12μm 3.緩沖液： 用于配置固定液，漂洗液，酶反應(yīng)孵育液 配制酶反應(yīng)孵育液 （1）清洗器皿，過酸沖洗 （2）現(xiàn)用現(xiàn)配，保持新鮮 （3) 嚴(yán)格配比，保持平和 （4）防止污染 過濾為佳 （5）優(yōu)選試劑，注意純度,4. 孵育反應(yīng) a. 溫度及時間：37oC，15-30min b. 孵育反應(yīng)：切片孵育；漂浮孵

12、育 5. 酶顯示方法 （1）同步顯示法 （2）二步顯示法（孵育后偶聯(lián)法） （3）底物自身顯示法,6. 酶特異性對照實(shí)驗(yàn),用酶活性抑制劑激活劑采用無底物的孵育液過固定或加熱改變孵育液選擇PH值細(xì)胞內(nèi)的定位差異,對結(jié)果分析要考慮的問題,經(jīng)冷凍和原位固定后，酶究竟能保存多少?酶是否在原位?反應(yīng)酶起了多少作用？酶的活性是否代表了細(xì)胞生活時的狀態(tài)?沉淀的產(chǎn)物是否代表酶本身，時間延長是否會有改變，有

13、沒有擴(kuò)散移位？,常用酶顯示方法 （1）同步顯示法：PRP + 輔助物 → 有色FRP 某些金屬本身或化合物生成顏色（eg.金屬離子沉淀反應(yīng)） 硫化鈷（黑色） 硫化鉛（棕黑色） （2）二步顯示法（孵育后偶聯(lián)法） 酶與底物作用產(chǎn)生的PRP沉積于原位，隨后行顯色反應(yīng) 適用于：PH反應(yīng)差別大；底物/輔助物易分解 局 限：要求PRP彌散度低 （3）底物自身顯示法

14、 可溶有色底物 → 不溶有色底物 底物分子重組,,(1) 金屬離子沉積法 — 酸性磷酸酶 Gomori反應(yīng)（1941年） 以beta-甘油磷酸鈉為底物，在酸性PH值(4.4-5.5)下，被酸性磷酸酶（ACP）水解，釋放出磷酸鹽。遇鉛離子（硝酸鉛/醋酸鉛）生成磷酸鉛(PRP)，再被S2-置換，最終生成硫化鉛棕黑色沉淀。 酶促反應(yīng) R-PO4Na2+H20

15、 R-OH +Pb3(PO4) 2 顯色反應(yīng) Pb3(PO4)2 + 3 S2- 3PbS （棕黑色沉淀） 該方法金屬離子容易反應(yīng)，沉著顆粒微細(xì)，反應(yīng)色調(diào)美麗，反差明顯 。,,,激活劑：Mn2+ 抑制劑：NaF定 位：溶酶體，ER， 胞漿該酶活性比較高的器官：肝、腎、腸、脾、腎上

16、腺注意事項(xiàng):鉛離子 濃度是關(guān)鍵：非特異性吸附，NaF處理排除假陽性孵育時間不宜過長：彌散，核非特異著色鉛法適用于: ACP； 5’-核苷酸酶； G6P酶；膜ATPase； 線粒體ATPase； TTPase(硫氨酸焦磷酸酶）,,（2）偶氮鹽偶聯(lián)反應(yīng) 人工合成的酶底物在酶的作用下產(chǎn)生PRP，后者與重氮鹽結(jié)合，引起偶聯(lián)偶氮反應(yīng)，使其生成不溶性的偶氮色素

17、堿性磷酸酶 a-萘基磷酸鈉 磷酸氫二鈉 + a -萘酚 α-萘酚 + Fast Blue 偶氮染料 （藍(lán)色沉淀） 酯酶、轉(zhuǎn)肽酶、肽酶,,酶+水,,重氮鹽種類不同，

18、其偶氮顏色多樣（藍(lán)色，紫色，紅色，褐色等） 常用重氮鹽: 堅(jiān)牢蘭RR 堅(jiān)牢蘭B 堅(jiān)牢蘭RC 堅(jiān)牢蘭TR 堅(jiān)牢蘭B 六偶氮副品紅 六偶氮新品紅常用底物：萘酚AS-B1 萘酚AS-D 萘酚AS-MX 萘酚AS-TR應(yīng)用：ALPase, ACPase 酯酶， 轉(zhuǎn)肽酶，肽酶， beta-葡糖苷酶方法：同時偶聯(lián)法 后偶聯(lián)法：防止重氮鹽對酶的抑制作用,(3) 四唑反應(yīng)

19、 底物 氫離子 與無色四唑鹽結(jié)合常用四唑鹽種類: 三苯四唑氯化物 TTC 藍(lán)四唑鹽 BT 新四唑鹽 NT 硝基蘭四唑鹽(nitroblue tetrazolium, NBT) 四硝基蘭四唑TNBT 噻唑蘭 (3(4,5-dimethyl thiazolyl-2YL) 2

20、,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT),單胺氧化酶和幾乎所有的脫氫酶都可以用四唑反應(yīng)顯示 例：四唑鹽法顯示琥珀酸脫氫酶 以琥珀酸（鈉鹽）為底物，在酶的作用下脫氫，人工合成的硝基藍(lán)四唑（NBT）為受氫體，還原為紫色不溶物以代表琥珀酸脫氫酶的活性 琥珀酸脫氫酶是線粒體的標(biāo)記酶之一，存在于所有有氧呼吸的細(xì)胞，以心肌、腎曲管上皮、肝細(xì)胞含量最豐富,(4) 聯(lián)苯胺色素法過氧化物酶（聯(lián)

21、苯胺法）,NH2,NH2,酶 + H2O2,NH,NH,棕色沉淀,2H,聯(lián)苯胺,聯(lián)苯胺藍(lán),過氧化物酶催化各種物質(zhì)被過氧化氫所氧化見于乳腺、甲狀腺、唾液腺、肥大細(xì)胞等髓過氧化物酶見于中性/嗜酸性白細(xì)胞及其前體細(xì)胞，對造血系統(tǒng)疾病的鑒別診斷極為重要辣根過氧化物酶（HRP）作為大分子示蹤劑 DAB 3-二氨基聯(lián)苯胺,(5) 靛藍(lán)反應(yīng) 底物被酶分解為二個PRP，其中之一可在一定條件下形成不溶的

22、靛藍(lán) 酯酶 吲哚酚酯 吲哚酚 + RCOOH 2 吲哚酚 靛藍(lán) 膽鹼酯酶、磷酸酶、糖苷酶、非特異酯酶,,,酶 + 水,氧化,酶組織化學(xué)的應(yīng)用,了解組織、細(xì)胞的代謝活動細(xì)胞類型的判斷了解細(xì)胞定位用于腫瘤的研究用于免疫組化和雜交組化的顯示手段,（1）觀察組織細(xì)胞代謝心肌梗死2小時 琥珀酸

23、脫氫酶 細(xì)胞色素氧化酶 HE無改變 異檸檬酸脫氫酶 磷酸化酶,,Reye’s Syndrome　　又稱腦病脂肪肝綜合征，是一種急性腦病和肝臟脂肪浸潤綜合征,常常發(fā)生于某些急性病毒性傳染病以后，多見于兒童，臨床表現(xiàn)為：急性致死性腦病、脂肪肝、肝功能衰竭，

24、高血氨 肝細(xì)胞琥珀酸脫氫酶活性下降,（2）細(xì)胞類型 / 細(xì)胞定位 氯乙酸酯酶 → 中性粒細(xì)胞 （被抗CD66C, CD66D, CD88抗體的免疫組化代替） 非特異性酯酶 → Mf （被抗CD64、CD68抗體的免疫組化代替） 乙酰膽鹼酯酶 → 小腸 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 ATP酶 → 皮膚 郎罕氏細(xì)胞,,（3）癌前病變的標(biāo)志

25、 以肝癌發(fā)生為例 早期，HE無明顯變化，但酶組織化學(xué)觀察到 糖代謝紊亂,肝細(xì)胞癌,增生結(jié)節(jié),GGT,AFP,G6P,,小肝細(xì)胞,,,過渡細(xì)胞,,卵圓細(xì)胞,肝細(xì)胞,,,嗜堿,嗜酸,,,（4）免疫組化和雜交組化的顯示方法 與酶組化的不同，在于是檢測引入酶 免疫組化常用HRP（DAB + H2O2） 雜交組化常用AP （ BCIP + NBT ）,掌握內(nèi)容,酶