用于環(huán)境污染物分析的毛細管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測方法研究與應(yīng)用.pdf

1、毛細管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)是以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度或/和分配系數(shù)的差異而實現(xiàn)高效、快速分離的一類新型液相分離技術(shù)。CE以其高效、快速、經(jīng)濟、環(huán)保、樣品用量少等優(yōu)點，逐漸成為無機分子、有機分子、生物大分子和對映體分離檢測、生物醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、分析化學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域中中最具活力、最有發(fā)展前景的分離分析科學(xué)之一。激光誘導(dǎo)熒光(Laser-Induced F

2、luorescence，LIF)檢測，其突出的優(yōu)點就是靈敏度高，可高達10-9～10-12 mol/L。CE與LIF聯(lián)用，結(jié)合了兩者的優(yōu)點，快速、高效、靈敏，非常適合生物樣品及環(huán)境中痕量物質(zhì)的分析。
　　 隨著經(jīng)濟和人們生活水平的發(fā)展，人類賴以生存的自然環(huán)境變得越來越糟，環(huán)境問題日益突出，一些化學(xué)品的使用給環(huán)境甚至人類的健康帶來了深遠的危害。溴代阻燃劑(BFRs)是一種用于某些高分子聚合物材料、樹脂的生產(chǎn)過程中以阻燃、抗燃、減少

3、火災(zāi)可能性的物質(zhì)。由于近年來BFRs，特別是四溴雙酚-A(TBBPA)，在人們生產(chǎn)生活中的廣泛使用，加之其具有難降解性和高脂溶性，能夠通過食物鏈在生物體內(nèi)累積，使處于高營養(yǎng)級的生物受到毒害，最終導(dǎo)致對人體健康的危害。近年來，溴代阻燃劑的環(huán)境安全問題逐漸引起了人們的重視，但從分子角度對其生物毒性方面的研究還較少。農(nóng)藥殘留也是一個突出的環(huán)境問題，對水、土壤、大氣等環(huán)境介質(zhì)造成污染，其引發(fā)的食品安全問題也令人擔(dān)憂。
　　 根據(jù)上述研究

4、現(xiàn)狀，本論文以研究環(huán)境污染及其影響為出發(fā)點，建立了快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測谷胱甘肽、甲狀腺激素及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的毛細管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測法。同時建立SD大鼠的TBBPA受損模型，初步探討TBBPA對生物體的毒性效應(yīng)。
　　 全文共分以下四個部分：
　　 1、緒論(第一章)
　　 該部分首先概述了毛細管電泳的發(fā)展、原理及其應(yīng)用現(xiàn)狀；其次分別概述了溴代阻燃劑和農(nóng)藥殘留的污染現(xiàn)狀及其研究現(xiàn)狀；最后詳細綜述了毛細管電泳

5、在環(huán)境污染物分析中的應(yīng)用。
　　 2、毛細管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測對還原型和氧化型谷胱甘肽分析的方法研究及其在TBBPA暴露下對大鼠體內(nèi)谷胱甘肽含量影響的應(yīng)用(第二章)
　　 谷胱甘肽以原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)兩種形式廣泛存在于生物體內(nèi)。谷胱甘肽在體內(nèi)起著重要的作用，比如維持血紅蛋白中鐵離子的狀態(tài)、阻止血液中含巰基蛋白質(zhì)的氧化等。GSH/GSSG則標(biāo)志著體內(nèi)氧化應(yīng)激的程度。我們通過檢測大鼠腦中和血

6、清中GSH和GSSG的含量變化來研究TBBPA的生物毒性。
　　 本文以FITC為熒光衍生試劑，建立了用于同時分離檢測還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的毛細管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測法。對衍生緩沖液和運行緩沖液的pH和濃度、進樣時間、分離電壓等影響測定的因素進行了優(yōu)化，獲得最佳測定條件為：兩種化合物在pH9.9，50 mmol/L的硼砂緩沖體系中衍生，并在pH9.7，50 mmol/L的硼砂緩沖液中進行分離檢測。

7、GSH和GSSG在3-1000 nmol/L范圍內(nèi)，熒光強度與濃度呈良好的線性關(guān)系，檢出限分別為3.0×10-10 mol/L和1.0×10-9 mol/L(S/N=3)。并將該方法用于四溴雙酚-A(TBBPA)暴露后大鼠體內(nèi)GSH、GSSG含量的變化，探討其可能的生態(tài)毒理效應(yīng)。
　　 3、毛細管電泳激光誘導(dǎo)熒光法對甲狀腺激素測定方法的研究及其在TBBPA暴露下大鼠體內(nèi)甲狀腺激素含量影響的應(yīng)用(第三章)
　　 甲狀腺是人

8、體內(nèi)最大的內(nèi)分泌腺體，其分泌的甲狀腺激素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)在多種生理過程中起著極其重要的調(diào)節(jié)作用，比如個體的生長和發(fā)育、碳水化合物的新陳代謝、氧氣的消耗過程、蛋白質(zhì)的合成和胎兒早期的神經(jīng)發(fā)育等。TBBPA與甲狀腺激素具有相似的結(jié)構(gòu)，作用于機體后將影響甲狀腺素的正常分泌，引起甲狀腺干擾效應(yīng)。因此我們通過檢測大鼠體內(nèi)T4和T3的含量變化探討TBBPA的甲狀腺激素干擾效應(yīng)，為甲狀腺激素干擾物篩選方法的建立奠定基礎(chǔ)。
　　

9、 本文以異硫氰酸熒光素(FITC)為衍生試劑，建立了用于同時分離檢測甲狀腺激素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)的高效、靈敏的毛細管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測方法(CE-LIF)。我們分別對衍生化條件如衍生緩沖液的類型、pH和濃度，以及衍生劑濃度進行了優(yōu)化；同時也對影響毛細管電泳的分離條件包括運行液緩沖液、分離電壓、進樣時間等因素進行逐一優(yōu)化以獲得良好的分離效率和靈敏度。在最佳條件下，兩種化合物在pH9.2，25 mmol/L的磷酸鹽緩沖體系中

10、經(jīng)FITC衍生后用CE-LIF在含15％乙腈(v/v)的硼砂緩沖體系(pH8.9，40 mmol/L)中于10 min內(nèi)得到分離。在0.003～1μmol/L范圍內(nèi)，T4和T3的熒光強度與濃度呈良好的線性關(guān)系，檢出限分別為3.0×10-9mol/L和1.0×10-9mol/L(S/N=3)。并將該方法用于四溴雙酚-A(TBBPA)暴露后大鼠體內(nèi)T4和T3含量的變化，探討其可能的生態(tài)毒理效應(yīng)。
　　 4、毛細管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測

11、法在氨基甲酸酯類農(nóng)藥的理化性質(zhì)研究中的應(yīng)用(第四章)
　　 氨基甲酸酯類農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中較為常用的一類農(nóng)藥，具有殺蟲效率高、選擇性強、分解快、殘留期短等特點。但隨著其廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，造成對環(huán)境的影響，特別是水體，直接危及到人體的健康。這類農(nóng)藥作用于生物體時會抑制其體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性，急性中毒時會出現(xiàn)肌肉顫動、瞳孔縮小等膽堿酯酶抑制癥，危害生物體的神經(jīng)系統(tǒng)。因此對環(huán)境中及食品中一些微量農(nóng)藥殘留的靈敏檢測及對其理化性質(zhì)的研究

12、具有非常重要的現(xiàn)實意義。
　　 本文通過毛細管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測法對滅除威(XMC)、混殺威(2，3，5-trimethacarb)、滅蟲威(mercaptodimethur)等三種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的水解產(chǎn)物進行檢測，從而測定它們的水解常數(shù)及活化能。該法基于氨基甲酸酯類農(nóng)藥水解產(chǎn)生的甲胺與熒光衍生試劑4-氯-7-硝基-2，1，3-苯并二唑(NBD-C1)進行衍生化反應(yīng)，再用毛細管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測法測定。文中對水解和衍生反應(yīng)

13、的時間及溫度、衍生緩沖液和運行液緩沖液的pH值及濃度、分離電壓、進樣時間等因素進行了逐一優(yōu)化以期達到檢測的最佳條件。在20mmol/L pH9.8的硼砂緩沖液中，三種農(nóng)藥分別發(fā)生水解反應(yīng)并與NBD-C1進行衍生化反應(yīng)，隨后在50 mmol/L，pH8.5的硼砂運行液中經(jīng)毛細管電泳激光誘導(dǎo)熒光法得到分離檢測。三種農(nóng)藥的檢出限分別可達3.0×10-9、1.0×10-9和3.0×10-9mol/L(S/N=3)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.2