光纖LED誘導(dǎo)熒光毛細管電泳檢測技術(shù)的研究與應(yīng)用.pdf

1、高效毛細管電泳(HPCE)是廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域(如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、單細胞分析)及其它領(lǐng)域(包括食品化學(xué)、藥物化學(xué)、環(huán)境化學(xué)、毒物學(xué)、醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)等)的一種新型分離分析技術(shù)。具有自動化程度高、分離速度快、樣品用量少、分離效率高、檢測模式多樣等特點。HPCE中的熒光檢測技術(shù)因其具有高的靈敏度而成為檢測痕量樣品的首選。本文以發(fā)展光纖發(fā)光二極管(光纖LED)誘導(dǎo)熒光HPCE檢測技術(shù)為出發(fā)點，并將其運用于生物體液中游離氨基酸、煙葉

2、中游離氨基酸的分離分析研究。實驗結(jié)果證明此新的熒光檢測技術(shù)不僅簡單易行、耗費低，而且具有高的檢測靈敏度和低的背景噪音，方法準確可靠。 1．光纖LED誘導(dǎo)熒光HPCE檢測儀測定生物體液樣品中游離的興奮性氨基酸。興奮性氨基酸作為腦內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)對正常的神經(jīng)生理活動有著十分重要的作用，它和某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，因此研究體液中的興奮性氨基酸有著重要的意義。本文實驗中所選擇的生物體液樣品包括兔血清、人血清

3、、人體腦脊液。以2，3-萘二甲醛(NDA)標記的游離氨基酸衍生產(chǎn)物作為檢測對象，通過對分離電壓、緩沖溶液濃度和pH值實驗條件進行優(yōu)化，取得了良好的分離效果。優(yōu)化的實驗條件為：有效長度為50cm的非涂層熔融硅毛細管，內(nèi)徑為75μm；電泳緩沖液為lOmmol/L的四硼酸鈉緩沖液 (pH9.3)；分離電壓20kV；檢測溫度為室溫；檢測器為自組裝的光纖LED誘導(dǎo) 熒光檢測器，采用最大發(fā)射波長為425nm的LED。在此條件下，谷氨酸和天冬氨酸

4、的最低檢測限分別達到2.1×10<'-8>和2.3×10<'-8>mol／L；相對標準偏差均小于5.0％；谷氨酸和天冬氨酸分別在5.2×10<'-8>～2.6×10<'-8>mol／L和5.8×10<'-8>～2.9× 10<'-8>mol/L的濃度范圍內(nèi)與熒光峰強度呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均大于0.999?；厥諏嶒灲Y(jié)果顯示，所建立的方法對谷氨酸和天冬氨酸的回收率均大于90.0％。以上結(jié)果說明該方法的重復(fù)性、最低檢測限和回收率均能滿

5、足生物體液中微量興奮性氨基酸檢測的需要。 2．光纖LED誘導(dǎo)熒光HPCE檢測儀測定煙葉中的游離氨基酸。氨基酸是煙草和煙氣的香味成分之一，也是煙草中的一類重要致香前體物質(zhì)，氨基酸的含量與煙草的品質(zhì)有著密切的關(guān)系，故檢測煙葉中氨基酸的含量是非常有意義的。用毛細管電泳測定煙葉中氨基酸的實驗方法少有報道。實驗中用0.1mol／L的鹽酸溶液超聲振蕩提取煙葉中的游離氨基酸，在氰化鉀存在下用NDA進行柱前衍生化反應(yīng)，再經(jīng)HPCE分離。煙葉中有

6、8種氨基酸基本達到完全分離，其相對標準偏差均小于6.5％；回收率為88.7％～104.3％；檢測限最低可達到1.2×10<'-7>mol/L標樣中9種氨基酸在5.8×10<'-7>～9.6×lO10<'-5>mol/L的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以上結(jié)果說明該方法的靈敏度高、重現(xiàn)性較好、可用于煙葉中游離氨基酸的檢測。 通過對實際樣品的分析考察證明，光纖LED誘導(dǎo)熒光HPCE檢測系統(tǒng)不僅經(jīng)濟簡單而且靈敏度高，