單克隆抗體技術及其應用-孟衛(wèi)青

1、單克隆抗體技術及其應用,講解人：孟衛(wèi)青,,,,,,,,單克隆抗體技術簡介,一,二,三,四,五,單克隆抗體的制備過程,基因工程抗體制備技術,鼠源抗體人源化,,,六,七,抗人CD3抗體基本來源,基因工程抗體的廣泛應用,已批準上市的治療性單抗,培訓大綱,1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴細胞雜交瘤技術，兩人由此杰出貢獻而榮獲1984年度諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。單克隆抗體（monoclonal antibody）：針對預定抗原

2、的同一抗原決定簇的，高度同質(zhì)的，且能保證無限量供應的抗體。單克隆抗體技術的理論依據(jù)：抗體的多樣性、克隆選擇學說、抗體基因的重排理論、抗體結構與生物合成機制。,一.單克隆抗體技術簡介,骨髓瘤細胞 （SP2/O-Ag14 ）：,1.1 單克隆技術的原理,喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT－）無法在HAT選擇培養(yǎng)劑中生長能

3、無限地快速增殖 既不合成輕鏈又不合成重鏈,小鼠脾細胞 （B-Cell ）：,合成和分泌特異性抗體無法進行體外長期培養(yǎng),脾細胞－SP2/O融合細胞：,HGPRT＋，能在HAT選擇培養(yǎng)劑中生長能無限地快速增殖 合成和分泌特異性抗體,HAT,次黃嘌呤，甲氨喋呤，胸腺嘧啶核苷,,二.單克隆抗體的制備過程,2.1 單克隆抗體制備過程的注意事項,嚴格進行無菌操作，防止污染（細菌、霉菌、支原體、細胞）根據(jù)實驗的目標及時進行細胞的檢測與篩選，

4、（ELISA、(酶聯(lián)免疫吸附實驗)IFA（時間分辨免疫熒光）、凝集、中和…）對篩選得到的陽性細胞克隆進行早期單克隆（有限稀釋法）在單克隆細胞建株過程中不定期驗證檢測防止單克隆細胞過度生長 ——老化 死亡,,細胞融合的方法：1、仙臺病毒，2、PEG/DMSO，3、電融合,,2、治療試劑病毒等微生物的中和抗體抗毒素—蛇毒、破傷風毒素，等被動免疫治療制劑“生物導彈”，腫瘤治療等,3、分子生物學研究工具蛋白

5、質(zhì)等生物活性分子的純化；細胞生物學——組織定位；分子病毒學——結構分析；特定生物分子的功能研究；,診斷技術方法：ELISA（間接法、夾心法、競爭法）免疫熒光法膠體金放射免疫法??? ???,2.2.單克隆抗體技術的應用,,,B,,D,,A,,C,污染：培養(yǎng)環(huán)境、操作,抗體分泌不足：支原體污染、細胞突變、 培養(yǎng)體系有問題,融合細胞不生長：PEG、血清、HAT培養(yǎng)基,雜交瘤細胞難以克隆化：血清質(zhì)量、細胞活性,2.3 單抗制

6、備常見問題,三.基因工程抗體制備技術,鼠源抗體人源化,01,,,02,小分子抗體,,03,抗體融合蛋白,3.1.單抗人源組分的分類,原核表達,抗體人源化,小分子抗體,雙功能抗體,易于改造,親和力成熟,產(chǎn)業(yè)化,3.2 基因工程抗體優(yōu)點,抗體名稱 抗體種類 靶向抗原 適應癥 批準日期OKT3 鼠單抗 CD3 移植排斥

7、 1986Panorex 鼠單抗 17-1A 大腸癌 1995ReoPro 人-鼠嵌合Fab 血小板受體 冠心病 1994Rituxan 人-鼠嵌合抗體 CD20 淋巴瘤 1997Simulect 人-鼠嵌

8、合抗體 CD25 移植排斥 1998Remicade 人-鼠嵌合抗體 TNF-α 炎癥性腸病、 1998類風濕關節(jié)炎 1999Zanapax 人源化抗體 CD25 移植排斥 1997Herceptin 人源化抗體 HER-2 乳腺癌

9、 1998Synagis 人源化抗體 RSV F蛋白 RSV感染 1998Mylotarg 人源化抗體 - CD33 淋巴瘤 2000 Campath 人源化抗體 CD52 淋巴瘤 2001,,四.已批準上市的治療性單

10、抗,就是利用DNA重組技術把鼠單抗的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體的恒定區(qū)域的表達載體中，并轉(zhuǎn)入合適的宿主表達出來的抗體。這樣抗體即具有識別抗原的特異性，又減少了抗體的人抗鼠反應。,嵌合抗體,一.,改型抗體,二.,指利用基因工程技術，將人抗體可變區(qū)（V） 中互補性決定區(qū)（CDR）AA序列改換成鼠源單抗CDR序列，重構成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。,五.鼠源抗體人源化,可變區(qū)基因的克隆表達載體的構建

11、嵌合抗體的表達,5.1嵌合抗體,5.2嵌合抗體抗體制備簡易圖,,六.抗人CD3抗體基本來源,關系圖譜,1.CD3分子是T細胞的重要標志，由γ、δ、ε、ζ和η五種多肽鏈組成，它們的胞漿區(qū)均含有ITAM，具有傳導TCR信號的功能，使T細胞活化。,2.從外周血、骨髓或臍血中分離出的單個核細胞在CD3單克隆抗體和多種細胞因子存在的條件下，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)可以獲得具有腫瘤細胞殺傷活性的CIK（Cytokine-induced Killer）細

12、胞,6.1 抗人CD3抗體與免疫細胞,1 .在腫瘤治療方面的應用: 單抗藥物抗腫瘤能有效地降低傳統(tǒng)腫瘤藥物治療的不良反應。如2005年我國開發(fā)出癌癥治療藥——重組人源化抗人表皮生長因子受體單克隆抗體(商品名：泰欣生)。泰欣生聯(lián)合放療治療鼻咽癌的完全緩解率比單純放療的患者提高30%以上。2 .在器官移植中的應用: 近年來 ,利用抗體藥物作為實體器官移植的誘導治療逐漸增加。如1986年批準

13、進入美國市場的治療性抗體類藥物抗 CD3單抗即被用于腎、 心臟、 肝臟移植排斥的逆轉(zhuǎn)。 3 .在心血管疾病方面的應用： 美國 FDA 于 1994 年批準了第一個人-鼠嵌合 Fab 抗體的上市，該抗體現(xiàn)已被廣泛應用于多種心血管疾病治療 ,主要用于預防冠狀動脈成形術后的再狹窄4 .在自身免疫性疾病方面的應用: 現(xiàn)有的研究表明 ,抗體對類風濕性關節(jié)炎、 系統(tǒng)性紅斑狼瘡、 牛皮癬、 多發(fā)性

14、硬化、 硬皮病、 潰瘍性結腸炎等療效較好。。。。。,七.基因工程抗體的廣泛應用,所以可行的方法就是在完善人抗體技術的同時，推進治療性小分子抗體衍生物的研究，根據(jù)臨床的實際設計靈活有效的治療方案，使人源化抗體和小分子抗體互為補充。,7.1單抗未來發(fā)展的方向,01,02,抗體人源化以及完全人源化抗體的制備已經(jīng)成為當今治療性抗體的發(fā)展趨勢，同時，各種抗體衍生物免疫原性低、更易通過血管壁到達病源，通過PEG化等方法可以延長其半衰期；,03,人抗

15、體是否可以解決鼠抗體運用中出現(xiàn)的所有問題，還有待大量臨床試驗的檢驗。,01,減少降低了機體的免疫排斥反應,02,募集效應因子或效應細胞,03,在體內(nèi)的半衰期長,7.2 人源化抗體優(yōu)點,對于該現(xiàn)象的解釋是：人源化抗體中的Fc段可以特異結合人血管內(nèi)皮細胞上的Fc受體（FcRn)，使抗體內(nèi)化到血管內(nèi)皮細胞而不被降解，并能夠回到血液中參與循環(huán)。鼠抗體由于不能有效的與人FcRn結合而很快從循環(huán)系統(tǒng)中清除。,7.3抗體生產(chǎn)生物反應器,,謝謝!聆聽